[发明专利]一种用于基因纯化的装置及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于基因纯化的装置及纯化方法。

背景技术

质粒被作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要载体，它可以把目的DNA片段通过重组DNA技术，导入受体细胞中去进行复制和表达。因此质粒提取的质量对后续的分子生物学实验的成败起着关键的作用。目前许多国内外公司都研发和提供了质粒提取试剂盒，但这些试剂盒提取质粒时，需要经过繁琐的步骤，耗时长。且试剂盒中采用许多有毒化学物质，即污染环境又会威胁到操作者的健康。

目前提取细菌质粒DNA的方法主要有：1.酚-氯仿-异戊醇抽提；2.离心柱型质粒提取；3.磁珠法质粒提取；4.基于DEAE的重力柱法质粒提取。

以上四种方法各有缺陷。第一种方法含对人体有毒的有机溶剂，操作危险；第二种方法需要多次使用离心机，操作繁琐，提取过程中有晾干挥发乙醇步骤，增加了时间耗费；第三种方法磁珠易被氧化，且磁力、吸附量与磁珠大小、比表面积成比例，比表面积大，则吸附量高，体积小，磁力小，不易吸附到磁力架上，消耗时间长；第四种方法成本较高，依靠重力作用让液体流过柱子，流速慢，耗时长，洗脱体积大，盐离子浓度高，最后需对产物浓缩。

基因组DNA制备是分子生物学研究的关键技术，细菌样品中DNA的提取效率和质量对后续研究极其重要。所提取DNA的浓度、纯度及片段大小，对后续PCR、克隆的效果产生了一定影响。理想的基因组DNA提取方法不但要考虑DNA提取得率，还要尽可能地保证DNA的纯度。目前常用的微生物基因组纯化方法主要有碱裂解法、酚-氯仿法等。这些方法普遍存在产物不纯、操作繁琐等问题,且无法摆脱对高速离心机的依赖。

PCRClean作为对PCR产物纯化的一种方法，其纯化效率直接影响到下步酶切反应的进行，纯化效率低会导致整个转化效率过低。

胶回收是对基因片段选择性回收的主要方法，其本身回收体系较为有限且常规溶胶液对基因损伤较大，对回收率及纯度要求更高。

发明内容

为了解决在基因纯化过程中目前存在的使用有毒有机溶剂、多次使用离心机，操作繁琐、提取时间过长、成本高等问题，本发明提供了一种基因纯化方法。本发明的方法操作简便，无需多次离心，节约时间、可重复使用，节约成本、可实现大批量提取、不添加任何有毒有机溶剂。本发明利用实验室常规耗材及药品实现了细菌基因组及质粒、PCRClean以及胶回收的低成本、高效率纯化。

本发明的第一个目的是提供一种用于基因纯化的装置，所述装置包括吸头、套筒、筛板和推杆，吸头与套筒前端紧密贴合，筛板为与套筒内壁横截面大小配合的圆片状，筛板、推杆依次置于套筒内部，并分别与套筒内侧壁紧密贴合。在筛板与套筒前端之间，放置有吸附材料。

作为优选，所述吸附材料为SiO₂粉末；

作为优选，所述SiO₂粉末的粒径为20-80μm。

作为优选，所述装置的规格为2.5ml、5ml、10ml、20ml、50ml、100ml或300ml。

作为优选，所述装置的容积与SiO₂的用量比为：2.5ml：0.1g或2.5ml：0.05g。

本发明的第二个目的是提供应用上述装置提取细菌质粒DNA的方法，当所述装置的规格为2.5ml时，提取细菌质粒DNA的步骤如下：

(1)将革兰氏阴性菌扩大培养后，取1-6ml菌液，离心弃上清；

(2)加200μl细胞悬浮液以悬浮步骤1中的细菌；

(3)向步骤(2)的细胞悬浮液中加入200μl细胞裂解液，温和颠倒混匀2-3次，此时溶液应变为澄清，步骤(3)操作时间不超过1分钟；

(4)向步骤(3)的溶液中加300μl质粒结合液，温和颠倒混匀3-5次，12000rpm离心5-8分钟；

(5)用权利要求1-4任一所述的装置吸取ddH₂O1-2ml清洗2-3次，挤干；装置中，SiO₂粉末的质量为0.1g；

(6)拉动推杆将步骤(4)中的离心上清吸入权利要求1或2所述的装置中，上下颠倒混匀3-5次，推动推杆挤出液体；

(7)拉动推杆吸入500μl去蛋白液，上下颠倒2-3次，挤出液体；

(8)拉动推杆吸入500μl洗涤液1，上下颠倒2-3次，挤出液体；

(9)重复步骤(7)一次；

(10)拉动推杆吸入400μl洗涤液2，迅速混匀挤出液体；