[发明专利]一种快速筛选天然产物活性成分的细胞膜磁性微球制备及其应用

说明书

技术领域

本发明专利属于亲和色谱筛选天然产物活性成分领域。涉及一种细胞来源的细胞膜亲和色谱材料的制备以及应用该材料结合色谱质谱联用技术筛选天然产物中活性成分。该技术可实现靶向快速筛选天然产物含有的具有生物学活性的物质的目的。

背景技术

天然产物是活性化合物发现的主要来源。例如，青蒿素就是从中药青蒿中分离、发现的。目前该化合物及其衍生合成物已作为有效的抗疟药而广泛应用于临床。然而，从天然产物中筛选候选药物往往遵循先化学分离，后分析鉴定，再结合药效实验以确定有效成分的方法。然而，这样的化学成分分离、结构鉴定及活性评价体系，局限于现有色谱技术的分离纯化能力，只能分离得到稳定的单体有机化学成分；水溶性成分、微量成分和不稳定成分则较难以得到。因此，如何快速鉴别天然产物中的活性化合物仍是一个亟待解决的问题。

由于50％以上已上市药物作用的主要目标就是膜蛋白。故Wainer教授以及贺浪冲教授等人开发了一系列基于细胞膜的色谱法，这些方法分别用于研究膜蛋白的相互作用，筛选活性化合物的复杂混合物等方面。目前已有23种细胞膜色谱模型已被用于中药有效成分筛选，收到了较好的效果。然而，细胞膜色谱虽是可行的且有广泛应用前景的，但因该类方法需制备固定相并填充色谱柱，在使用过程中还需平衡色谱体系。这些操作过程不仅需要复杂的程序，而且需要高压泵来装填色谱柱。这个过程限制了细胞膜色谱的进一步广泛应用。

故朱荃教授等人对细胞膜色谱进行改进，直接用红细胞细胞膜垂钓当归中潜在的活性成分。结合高效液相色谱、质谱、核磁共振技术，他们在红细胞膜解离液中确定了藁本内酯等具有潜在活性的化合物。这证明采用细胞膜可以“垂钓”天然产物活性成分是可以应用于预测成分在中药的生物活性的。然而该项技术仍需要反复超滤离心步骤分离与活性成分键合的细胞膜与提取液，且需对活性成分进行再分析。整个过程也很耗时。

配体垂钓法最初是从复杂的细胞基质蛋白和酶的提取目标生物分子固定在微型或纳米球进而筛选活性化合物的，应用磁性微球进行垂钓，主要依靠系统外部的磁力进行分离，更可以避免体系内的因素(例如，pH值，离子强度，或表面电荷)对分析工作的影响。2007年Moaddel等人在配体垂钓实验中第一次应用磁性微球。在工作中，研究人员将人血清白蛋白固定在硅胶磁性微球表面，垂钓混合物含有已知的配体和非配体。此后，越来越多的蛋白质被固定到磁性微球表面检测活性化合物。

然而，目前国内外，未见细胞膜被固定于这此类磁性微球的报道，也未见使用细胞膜磁性 微球筛选天然产物中的活性成分的报道。本专利基于细胞膜色谱技术将细胞膜固定于磁性微球表面，建立细胞膜磁性微球，并采用该微球结合质谱技术筛选天然产物中的活性成分。

发明内容

基于上述原因，本发明的目的是提供一种新的快速筛选天然产物活性成分的细胞膜磁性微球制备方法并应用其筛选天然产物中的活性成分。包括如下步骤：

(1)细胞膜悬液加入蛋白酶抑制剂后，用pH7-8的低渗液重悬细胞，超声破碎细胞。在4-10℃条件下，采用200-1000×g离心5-10min，取上清，再采用10000-20000×g离心15-30min，弃上清，取沉淀，采用5mM磷酸盐缓冲液(PBS)清洗沉淀3～5次，得到细胞膜。4℃贮存、备用。

(2)采用磁力或离心的方法将磁性微球从保护液中吸出。

(3)在振荡条件下，采用减压法将步骤1获得的细胞膜吸附于磁性微球表面，制备细胞膜磁性微球，将制备好的微球置于4-10℃，恒温振荡2-8h，使得细胞膜充分融合，即得。

(4)采用水或乙醇热回流提取药材活性成分1-3次，每次30min-120min，合并提取液，放冷，滤过后，4℃保存，备用。

(5)在37℃条件下，将细胞膜磁性微球与天然产物提取液共孵育10-60min。采用磁力、离心力等将吸附了活性成分的细胞膜磁性微球从提取液中分离，再采用磷酸盐缓冲液洗去未结合的化合物，采用10％-30％乙酸水溶液组成的解离液使活性化合物与细胞膜磁性微球表面的靶点解离，利用色谱质谱联用的方法测定解离液中的化合物组成。

与现有技术相比本发明的优点：