[发明专利]一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂

权利要求书

1.一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在于，这种依赖核酸内切 酶活性的核酸等温检测技术使用一种特殊的探针DNA分子，该探针DNA分子在没有和目的 核酸片段结合时，在溶液中保持一种二级结构，此时在该结构上没有特定的核酸内切酶的切 点；而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够识别目的片段上的特异性序列并和其 互补配对形成双链结构，从而改变探针DNA分子的二级结构，此时形成了至少具有三段双 链结构的的核酸分子；且其中两条双链为探针和目的核酸分子之间形成的，而另一条双链则 为探针DNA分子自己折叠形成的，这条探针DNA分子自己折叠形成的双链上，具有能够被 特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位点，形成检测中间体。

2.根据权利要求1所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在 于，使用能够识别检测中间体上由探针DNA分子自己折叠形成的双链上的识别位点的内切 酶，在该双链上的酶切位点位置切开探针DNA分子。

3.根据权利要求1所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在 于，被核酸内切酶切开的探针DNA分子能够在适合的温度下，即50℃至60℃之间，从待测 的核酸片段上解离下来，而待测片段重新和另一个探针DNA分子结合，开始一个新的结合- 重构-酶切-解离的过程；解离下来的探针DNA分子能够通过其他方法检测，作为目的核酸存 在的依据。

4.根据权利要求1所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂，其特征在 于，该技术即可以用于检测DNA分子也可以用于检测RNA分子，即和探针DNA分子结合 的目的核酸片段即可以是DNA分子也可以是RNA分子。

5.一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测试剂，其特征在于，检测试剂的组成中至少包 括以下成分：探针DNA分子，反应终浓度为0.05μmol/L，该分子形成的检测中间体上有能 够被某一核酸内切酶识别的识别位点和能够被该酶切开DNA分子的酶切位点；核酸内切酶， 含量为2U至10U，该核酸内切酶能够识别同一反应物中的探针DNA分子形成DNA双链， 且能够切开该DNA双链；能够保证该核酸内切酶活性的缓冲液成分；待检测核酸样本，待 检测核酸样本即可以是DNA也可以是RNA。

6.根据权利要求5所述的一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测试剂，其特征在于，检 测的方法为将检测混合物在50℃至60℃下使用恒温装置孵育该检测混合物1小时，反应温度 需要参考该检测混合物中核酸内切酶的最适反应温度；孵育结束后使用1％琼脂糖凝胶电泳检 测产物；将含有检测产物的琼脂糖凝胶放到紫外线下观察，分辨探针被切开的情况，如果出 现探针被切开时所显示的特征性条带则证明待检测核酸样品中存在着检测目的片段，反之则 证明待检测核酸样品中不存在检测目的片段。

7.一种依赖核酸内切酶活性的核酸荧光等温检测试剂，其特征在于，该试剂使用荧光探针， 该荧光探针分子在没有和目的核酸片段结合时，在溶液中保持一种二级结构，此时在该结构 上没有特定的核酸内切酶的切点；而当有目的核酸片段存在时，探针DNA分子能够识别目 的片段上的特异性序列和其互补配对形成双链结构从而改变探针DNA分子的二级结构，此 时形成了至少具有三段双链结构的的核酸分子，且其中两条双链为探针和目的核酸分子之间 形成的，而另一条双链则为探针DNA分子自己折叠形成的，这条探针DNA分子自己折叠形 成的双链上，具有能够被特定DNA内切酶识别的识别位点和能够被该内切酶切开的酶切位 点，形成检测中间体；而且在该荧光探针的两端分别标记有荧光基团和能够淬灭该荧光基团 所发荧光的淬灭基团。