[发明专利]一种依赖核酸内切酶活性的核酸等温检测技术和试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸检测技术，具体而言是一种依赖核酸内切酶活性的核酸检测技术和试剂。

背景知识

核酸等温检测技术是核酸体外检测技术的一种，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加等温扩增DNA聚合酶和各自特异性引物以及其他辅助酶类或报告基团来达到快速核酸扩增的目的。由于等温扩增的产物结构复杂，一般不适合用于分子克隆，主要用于核酸体外诊断。核酸等温扩增技术由于不需要使用PCR仪等专用设备，因此适合在基层医院和简易实验室中推广使用，因此近几年发展迅速。常见的等温扩增技术主要包括：环介导核酸等温扩增技术(Loop-mediatedIsothermalAmplification，LAMP)、滚环扩增技术(RollingCircleAmplification，RCA)、单引物等温扩增技术(SinglePrimerIsothermalAmplification，SPIA)、依赖解旋酶恒温扩增技术(Helicase-dependentIsothermalDNAAmplification，HDA)、依赖核酸序列的扩增(NucleicAcidSequenceBasedAmplification，NASBA)、链替代扩增(StrandDisplacementAmplification，SDA)、快速等温检测放大技术(RapidIsothermalDetectionandAmplification，RIDA)、交叉引物等温扩增(Crossprimingamplification，CPA)等。

上述方法可以分为三大类，第一类以RCA为代表的多步反应等温扩增检测方法，包括RCA、SPIA等。该类方法的特点是在反应过程中先通过一步反应合成检测中间体，而后对其进行等温扩增，实现核酸检测。以RCA为例，该技术是于1998年模拟自然界微生物环状DNA的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。先根据引物特异性，合成DNA环，作为等温扩增中间体，而后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下由一条引物与环形DNA模板的链置换合成，实现环状DNA模板的体外等温线性扩增。依据扩增过程中加入的引物不同可分为线性扩增、指数扩增、多引物扩增和信号扩增等。该类检测方法的缺点在于，需要多步反应才能得到检测结果，检测方法繁琐，费用较高，也较为费时，检测灵敏度也较低。

第二类，以LAMP为代表的多引物依赖于链置换酶活性的等温扩增检测技术，该类技术主要包括LAMP、CPA等。上述技术的核心是通过巧妙的引物设计，不需要使用连接酶等辅助酶直接通过扩增产生等温扩增中间体。进而依靠引物组扩增中间体上的特定片段，通过检测扩增产物实现核酸检测。以LAMP为例，该方法针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用BstDNA聚合酶在等温条件下扩增出双发卡状中间体，进而进入循环实现链增长，最终的产物为不同级数的扩增产物的混合物。反应产物可通过电泳或者根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断。此类方法具有快速、高灵敏度的特点但是由于气溶胶污染的原因，该类方法的假阳性结果较多，另外在进行引物设计时，要求目的片段在300bp之内具有150bp左右的保守序列，引物设计繁琐，而且在高突变率的RNA病毒基因组中，这样的序列是很难找到的，粗放的引物设计容易导致假阴性，这极大地限制了该方法的应用。

第三类，以RIDA为代表的不进行扩增的核酸检测技术。该类方法不依靠核酸扩增产生检测信号，而通过分子灯标的方法进行检测。以RIDA为例，该方法通过核酸切刻酶的活性，将和检测目的序列结合的分子灯标切开，产生荧光信号进行检测。该类方法由于核酸切刻酶种类有限，因此对目的序列限制较大。而且只能切刻DNA双链，不能直接检测RNA，因而并没有得到广泛的应用。

总之，核酸等温扩增技术在检验医学中体现出的最大的优势在于操作简单，检测时间较短，不需要依赖大型设备等几个方面。而目前的等温检测方法依然存在着一些缺欠，第一类技术方法由于需要在体系中加入连接酶、解旋酶等物质，需要多步反应完成，无法体现出操作简便的优势。第二类方法则对目的片段的保守性要求过高，引物设计复杂，容易引起气溶胶污染，其应用也受到了一定的限制。第三类方法还处于发展初期，RIDA方法需要切刻酶参与对检测目的序列提出了更高的要求，也没有得到广泛的应用。