[发明专利]干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒

权利要求书

1.干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括如下 步骤：

(1)样本前处理：用3/16打孔器打一个血斑样本到含内标溶液10μl的第一离心管中，加 入500μl丙酮，超声提取30min后，涡旋30min得到提取液；将提取液转移到第二离心管中，60 ℃吹干；

衍生：将100μl衍生剂加入到吹干后的残渣中，室温下反应1小时后加入80μl乙醇，涡旋 5min，60℃吹干；

复溶：将50μl80％甲醇加入衍生吹干后的残渣中进行复溶，涡旋5min，以13000rpm的 转速离心3min，取上层清液转移到内插管中，进样分析；

(2)采用高效液相色谱串联质谱技术检测经上述处理的干血片样品中25羟基维生素D， 其中采用的是多反应监测MRM扫描方式，所述色谱条件如下：

流动相C为纯甲醇，流动相D为纯水，柱温30℃，检测时间为5min，进样量为20μl；

采用梯度洗脱方式，洗脱参数见表1；

表1为梯度洗脱参数

25羟基维生素D3衍生物的保留时间为3.6min；

25羟基维生素D2衍生物的保留时间为3.8min；

所述多反应监测MRM质谱参数见表2，

表2为质谱参数

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱条件还包括正离子模式下，采用 APCI离子源，检测离子对m/z分别是：25-OHD3-PTAD558.4→298.2、25-OHD2-PTAD570.4→ 298.2、内标564.4→298.2，离子源位置为2.0；气帘气(CUR)为10，碰撞气(CAD)为6，离子喷 雾电流(NC)为4，温度为600℃，离子源气流(GS1)为60。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标溶液浓度为50ng/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5- 二酮，浓度为200μg/ml。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述涡旋采用涡旋混匀器。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述涡旋混匀器的转速为2500rpm。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血斑样本包括干血斑标准曲线样本、 质控干血斑样本和需要检测的血斑样本。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述干血斑标准曲线样本的制备：取2ml处 理过的全血，分别与4μl、10μl、20μl、50μl、100μl、200μl浓度为1μg/ml的25-OHD混匀，即得 2-100ng/ml干血斑标准曲线样本，分别取75μl制备好的上述样本滴到903滤纸上晾干即得。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述质控干血斑样本的制备：取2ml处理过 的全血，分别与16μl、40μl、80μl浓度为1μg/ml的25-OHD混匀，即得8ng/ml(Q1)、20ng/ml (Q2)、40ng/ml(Q3)质控干血斑样本，分别取75μl制备好的上述样本滴到903滤纸上晾干即 得；

所述处理过的全血通过将全血离心，去除上层血浆，将血细胞用0.9％生理盐水洗涤3 次后，与生理盐水1:1混匀即得。

10.干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测的试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒包含以下溶液：

(1)洗脱液：

洗脱液C：甲醇，纯度为100％；

洗脱液D：纯水；

(2)标准曲线干血片样品：含25羟基维生素D2，25羟基维生素D3的干血片，浓度为0- 100ng/ml；

(3)内标溶液：含有d6-25羟基维生素D3的甲醇溶液；

(4)萃取剂：丙酮，纯度为100％；

(5)衍生液：200μg/ml的4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)；

(6)终止液：乙醇，纯度为100％；

(7)复溶液：80％的甲醇；

(8)质控品干血片样品：含有25羟基维生素D2，25羟基维生素D3的干血片样品，浓度分 别为QC1：8ng/ml；QC2：20ng/ml；QC3：40ng/ml。