[发明专利]干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及25羟基维生素D检测的技术领域，特别涉及一种改良的液相色谱串联 质谱法检测25羟基维生素D。

背景技术

近十年来，大量研究显示维生素D在健康和疾病中发挥重要作用(Holick MF.DeficiencyofsunlightandvitaminD.BMJ2008；336:1318–9.HolickMF,Chen TC.VitaminDdeficiency:aworldwideproblemwithhealthconsequences.AmJ ClinNutr2008；87:1080S–6S.)。维生素D不仅与佝偻病、骨质疏松等密切相关，与癌症、高 血压、糖尿病、多发性硬化症、抑郁等也存在关系(HolickMF.VitaminDdeficiency.N EnglJMed2007；357:266–81.)。研究显示幼年时期维生素D水平与童年晚期或者成年时 期的许多紊乱疾病存在联系(McGrathJ.Does‘imprinting’withlowprenatalvitamin Dcontributetotheriskofvariousadultdisorders？MedHypotheses2001；56: 367–71.)，例如研究显示，胎儿期低维生素D水平不仅与新生儿股骨长度有关(MorleyR, CarlinJB,PascoJA,WarkJD.Maternal25-hydroxyvitaminDandparathyroid hormoneconcentrationsandoffspringbirthsize.JClinEndocrinolMetab2006； 91:906–12.)，还会在9岁时降低骨密度(JavaidMK,CrozierSR,HarveyNC,et al.MaternalvitaminDstatusduringpregnancyandchildhoodbonemassatage 9years:alongitudinalstudy.Lancet2006；367:36–43.)。鉴于维生素D水平与健康息息 相关，其水平的评估也越来越引起关注。25羟基维生素D是维生素D的稳定代谢物，能够准确 评估维生素D的水平。传统的维生素D检测方法是一些放射免疫的方法，由于存在蛋白交叉 反应，定量不准确。有文献报道维生素D2和D3这两种形式的维生素D在生物活性和生物利用 率上可能具有差异(Armasetc,(2004)J.Clin.Endocrinol.Metab.89:5387-5391)，而传统 的免疫方法不能区分维生素D2和D3。现在越来越多的维生素D检测采用液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS)的方法，该方法可以同时定量25羟基维生素D2和25羟基维生素D3，评估体内维 生素D2和D3的水平(AsukaMochizukl,YoshioKodera,TatsuyaSaito,et al.Preanalyticalevaluationofserum25-hydroxyvitaminD3and25- hydroxyvitaminD2measurementsusingLC–MS/MS.ClinicaChimicaActa420(2013) 114–120)，并且方法专属性和灵敏度性高。传统的25羟基维生素D检测方法有放射免疫法、 竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等，但是主要存在如下问题：第一、由于25羟基维生素D在 人体内主要与血清结合蛋白DBP结合，且人体内存在大量的高亲和力结合蛋白，因此检测存 在严重的基质干扰。而传统的放射免疫法和竞争蛋白结合法，不能有效祛除基质干扰；第 二，现有检测技术，前处理复杂、分析时间长，方法特异性差；第三，不能同时准确定量25羟 基维生素D2和25羟基维生素D3的含量，无法给出准确的25羟基维生素D的含量；第四，整个 检测过程时间长、通量低。本发明对25羟基维生素D检测方法进行改良，前处理更加简单、方 便，仅仅需要一步溶剂处理过程，达到蛋白沉淀和样本萃取双重效果，时间大大缩短。衍生 步骤，显著的提高了样本检测的灵敏度，可以将传统方法几百微升的样本量减少到几微升。

本申请检测的样本是干血片样本，可以居家采样，不用专业人员采样，样本量少， 常温保存和运输。不像常规的VD检测，需要到医疗机构，有专业人员采样，而且样本量大，样 本需要专业人员离心处理，并冷冻保存和运输。

发明内容