[发明专利]一种唾液中巴豆醛‑DNA加合物的测定方法

权利要求书

1.一种唾液中巴豆醛-DNA加合物的测定方法，所述巴豆醛-DNA加合物是1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG），其特征在于：包括以下具体步骤：

a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器对人体唾液进行标准化采集；

b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块；用超纯水复溶DNA；用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；

c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂缓冲液中；加入20 μL内标溶液和30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液；

d、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）标准工作溶液；

e、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量，在LC-MS/MS测定中，选取Thermo Acdiv^TM Polar Advantage II C18 色谱柱，规格4.6×150 mm，3 μm，流动相体系选取A：0.01%甲酸甲醇，B：10 mM乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序：0-2 min：25% A，2-17 min：35% A，17-25 min：25% A；流速为0.38 mL/min；分析时间为25 min，进样量为5 μL；

串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源ESI，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi，干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V, 碰撞能：9 eV，驻留时间：100 ms；监测离子对为Propano-dG：338.3→222.1定量离子对，338.3→117.2定性离子对；内标[¹⁵N₅]Propano-dG为343.2→227.2。

2.根据权利要求1所述的唾液中巴豆醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤c中所述的内标溶液为10 ng/mL的 [¹⁵N₅]Propano-dG。