[发明专利]一种唾液中巴豆醛‑DNA加合物的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于唾液样本的理化检验技术领域，主要涉及唾液中1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定唾液中巴豆醛-DNA加合物的方法。

背景技术

巴豆醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物，如工业生产、机动车尾气和卷烟烟气等；巴豆醛为可疑的人类致癌物，性质较活泼，易于鸟嘌呤上的碱基发生迈克尔加成-关环反应形成环外加成产物1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG），该加合物可抑制DNA的合成并导致错译。

唾液是一种非侵入式的样本采集方式，对受试者不造成影响样本易获得，是现成可用的DNA来源。口腔是烟气等有害成分直接暴露的靶器官，相关研究表明唾液中DNA的损伤与口腔癌相关。唾液中较丰富的细胞类型为口腔上皮细胞与白细胞，因其生命周期较短，唾液中DNA加合物的含量更加能显示致癌物的近期暴露情况，唾液在检测卷烟和食品致癌物产生的DNA加合物方面具有很大的应用前景。

目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有³²P-后标记技术、酶联免疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的唾液中巴豆醛-DNA加合物（Propano-dG）的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于唾液中巴豆醛-DNA加合物的定性定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种唾液中巴豆醛-DNA加合物的测定方法，即Propano-dG的测定方法，包括以下具体步骤：

a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG-500）对人体唾液进行标准化采集。

b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块。用超纯水复溶DNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL。

c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂缓冲液（pH=7）中，加入20 μL的[¹⁵N₅]Propano-dG内标溶液和30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述的内标溶液为10 ng/mL的 [¹⁵N₅]Propano-dG。

d、标准工作液的配制：用甲醇分别配制不同浓度的Propano-dG标准工作溶液。

e、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

色谱条件：选取Thermo Acclaim^TM Polar Advantage II C18 色谱柱（4.6×150 mm，3 μm），流动相体系选取A：0.01%甲酸甲醇和B：10 mM乙酸铵水溶液，洗脱条件为梯度洗脱：0-2 min：25% A，2-17 min：35% A，17-25 min：25% A；流速为0.38 mL/min。分析时间为25 min，进样量为5 μL。