[发明专利]一种巴豆醛‑DNA加合物的测定方法

权利要求书

1.一种巴豆醛-DNA加合物的测定方法，所述巴豆醛-DNA加合物是1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG），其特征在于：包括以下具体步骤：

a、巴豆醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的巴豆醛溶液，对照组加入同等体积的PBS溶液；将上述溶液放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；

b、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂缓冲液中，向DNA溶液中加入20 μL内标溶液和60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液；

c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的Propano-dG标准工作溶液；

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量，在LC-MS/MS测定中，选取Extend-C18色谱柱，规格1.8 μm，4.6×100 mm，流动相体系选取0.01%甲酸甲醇A和10 mM乙酸铵水溶液B，梯度洗脱条件为：0-2 min：32% A，2-7 min：42% A，7-10 min：32% A；流速为0.40 mL/min，分析时间为10 min，进样量为5 μL；

串联质谱检测器具体条件如下：电喷雾离子源ESI，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：600℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为45 psi，干燥气为50 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能：9 eV，驻留时间：150 ms；监测离子对为Propano-dG：338.3→222.1定量离子对，338.3→117.2定性离子对；内标[¹⁵N₅]Propano-dG为343.2→227.2。

2.根据权利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤a中巴豆醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM。

3.根据权利要求1所述的巴豆醛-DNA加合物的测定方法，其特征在于：步骤b中所述内标溶液为10 ng/mL的[¹⁵N₅]Propano-dG。