[发明专利]一种巴豆醛‑DNA加合物的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于DNA样本的理化检验技术领域，主要涉及DNA中1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG）加合物的测定技术领域，具体说是一种采用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定DNA中巴豆醛-DNA加合物的方法。

背景技术

巴豆醛是一种广泛存在于环境基质中的污染物，如工业生产、机动车尾气和卷烟烟气等；巴豆醛为可疑的人类致癌物，性质较活泼，易于鸟嘌呤上的碱基发生迈克尔加成-关环反应形成环外加成产物1,N²-丙醇-鸟嘌呤（Propano-dG），该加合物可抑制DNA的合成并导致错译。

目前，关于DNA加合物的分析检测方法报道的较多，主要有³²P-后标记技术、酶联免疫技术（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC-UV）和液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/MS）。其中LC-MS/MS由于其较高的灵敏度和选择性被广泛应用于DNA加合物的检测分析。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术建立的巴豆醛-DNA加合物（Propano-dG）的测定方法。该方法具有快速、准确、灵敏度高等特点，可用于DNA中巴豆醛-DNA加合物的定性定量分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种巴豆醛-DNA加合物的测定方法，即Propano-dG的测定方法，具体步骤如下：

a、巴豆醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的巴豆醛溶液(巴豆醛溶液用0.1 M的PBS溶液配制，浓度0.001-1 mM)，对照组加入同等体积的PBS溶液。将上述溶液放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL。

b、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris-HCl/5 mM MgCl₂缓冲液（pH=7）中，向DNA溶液中加入20 μL的[¹⁵N₅]Propano-dG内标溶液和60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h。水解液经Strata-X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液。此过程的目的是为了使双链DNA酶解成单核苷酸状态，通过固相萃取和氮吹浓缩纯化分离并富集所需的DNA加合物。所述内标为10 ng/mL的[¹⁵N₅]Propano-dG 。

c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的Propano-dG标准工作溶液。

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

色谱条件：Extend-C18（1.8 μm，4.6×100 mm）色谱柱，流动相体系选取A：0.01%甲酸甲醇和和B：10 mM乙酸铵水溶液，洗脱条件为梯度洗脱：0-2 min：32% A，2-7 min：42% A，7-10 min：32% A，分析时间为10 min，进样量为5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：600℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为45 psi，干燥气为50 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能：9 eV，驻留时间：150 ms。监测离子对为Propano-dG：338.3→222.1定量离子对，338.3→117.2定性离子对；内标[¹⁵N₅]Propano-dG为343.2→227.2。

本发明方法的线性范围和检出限：