[发明专利]一种利用大肠杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法

说明书

本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，属于生物工程领域。本发明通过表达胸苷磷酸化酶突变体，能有效提高单位菌体的总酶活，可有效降低抗爱滋病药物中间体β‑胸苷的生产成本。只要一般的发酵车间（如氨基酸、维生素生产车间）即可进行投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，属于生物工程领域。

背景技术

胸苷是一种重要的医药原料中间体和生化试剂，在生物化工领域的研究和生产中有着十分广泛的应用。胸苷是制备抗爱滋病药——叠氮胸苷(AZT)的重要原料，但要求其含量必须在98％以上，而且其中的5-甲基尿苷的含量不能超过0.3％。目前胸苷的制备主要有化学合成和DNA酶解两种方法：由化学合成法所得到的胸苷粗品中含有油状物，色素，5-甲基尿苷等胸苷衍生物，并且存在光学异构体难以去除；工艺过程中亦需要使用大量有毒有害的有机溶剂，对环境污染亦存在危险。而酶解法通过水解RNA或DNA等天然物质，所得到的胸苷粗品中含有脱氧腺苷(dA)，脱氧胞苷(dC)，脱氧乌苷(dG)，脱氧肌苷(dI)等杂质，分离提取十分复杂。

胸苷磷酸化酶在生物合成核苷药物中具有重要作用。合成出的核苷药物被广泛应用于医药领域，如治疗艾滋病的HIV逆转录酶抑制剂齐夫多定(AZT)、双脱氧肌苷(ddl)、扎西他滨(ddC)等。

胸苷磷酸化酶可特异性作用于β-胸苷，催化β-胸苷可逆磷酸化反应，由β-胸苷生成脱氧核糖-1-磷酸及胸腺嘧啶，亦可由脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶生成β-胸苷。

发明内容

本发明的发明目的是获得一种适合于工业化生产的利用大肠杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法，包括以下步骤：

(1)挑取含有SEQ ID NO.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于高压灭菌后的一级培养基中，30℃，250rpm，过夜培养；

(2)将步骤(1)获得的产品按照1∶100的接种比例接入到高压灭菌后的二级培养基中，于30℃中培养至菌体OD值5-6后，立即将其置于25℃中，震荡，250rpm培养1小时；

(3)向步骤(2)获得的产品中加入IPTG至其终浓度为0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；

(4)将培养液于4℃条件下，12000g下离心20分钟，收集湿菌体，然后利用菌体进一步发酵生产胸苷磷酸化酶。。

其中一级培养基由下列物质组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.8g/L，添加卡那霉素至50mg/L。

二级培养基由下列物质组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，磷酸氢二钠3.55g/L，磷酸二氢钾3.4g/L，氯化铵2.68g/L，硫酸钠0.71g/L，七水硫酸镁0.493g/L，六水氯化铁0.027g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.3g/L，添加卡那霉素至50mg/L。

上述描述中过夜是指12-16小时。

获得湿菌体后，还可以包括以下步骤：将湿菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。本发明中获得的菌体于-70℃保存。

其中，SEQ ID NO.3这一人工序列所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4，是一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体。

这一突变体是以大肠杆菌MG1655的胸苷磷酸化酶蛋白出发，通过将其第10位由Leu突变为Ala、第209位由Ala突变为Gly、第210位由Phe突变为Gly、第221位由Ala突变为Val、第413位由Ala突变为Asp得到一种新的胸苷磷酸化酶。