[发明专利]一种利用膜层析技术纯化α1-抗胰蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种α1-抗胰蛋白酶的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：

(1)将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解得到溶解液；

(2)向步骤(1)所得溶解液中加入PEG进行沉淀，取上清液；

(3)将步骤(2)得到的上清液进行微滤；

(4)将步骤(3)所得滤液经过阴离子交换膜层析吸附α1-抗胰蛋白酶，而后利用洗脱液进行洗脱，收集含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液；

(5)利用疏水层析膜色谱对步骤(4)所得含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液进行进一步纯化；

(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌、冻干得到所述α1-抗胰蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)使用缓冲液将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解；

优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液或醋酸缓冲液中的任意一种，优选为磷酸缓冲液；

优选地，所述缓冲液的pH值为6.5-8.5，优选7.0。

3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)所述使用缓冲液将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解后，在0-10℃下搅拌1-8小时，而后离心去除沉淀，得到溶解液；

优选地，所述离心转速为3000-8000转/分钟，优选5000转/分钟；

优选地，所述离心时间为20-60分钟，优选30分钟。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述PEG的分子量为2000-6000，优选4000；

优选地，步骤(2)所述加入PEG的浓度为1-100％，优选20％；

优选地，步骤(2)所述向步骤(1)所得溶解液中加入PEG进行沉淀的方法为：加入PEG，调节pH值至5.0-5.6，在0-10℃下搅拌1-4小时后，离心去除沉淀；

优选地，所述离心转速为3000-10000转/分钟，优选为8000转/分钟；

优选地，所述离心时间为20-60分钟，优选30分钟。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述微滤所用的微滤膜的孔径为0.08-0.8μm，优选0.45μm。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述阴离子交换层析膜为具有阴离子交换性能的分离膜；

优选地，所述阴离子交换层析膜的材质为聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚丙烯腈、醋酸纤维素中的任意一种或至少两种的组合，优选聚醚砜；

优选地，所述阴离子交换层析膜表面的有效基团为伯胺基、仲胺基、叔胺基或季铵型基团中的任意一种或至少两种的组合，优选季铵型基团。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述阴离子交换层析的上样条件为：样品pH值5.5-7.5，样品体积流速为4-20MV/分钟，样品缓冲液浓度为20-80mM；

优选地，步骤(4)所述利用洗脱液进行洗脱的条件为：洗脱液pH值6.5-7.5，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟，洗脱液盐浓度25mM-1M；

优选地，步骤(4)所述洗脱液为氯化钠水溶液或PBS缓冲液。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)所述疏水层析膜为具有疏水性能的分离膜；

优选地，所述疏水层析膜的材质为聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚丙烯腈、再生纤维素中的任意一种或至少两种的组合，优选再生纤维素；

优选地，所述疏水层析膜表面的有效基团为辛基、丁基、苯基中的任意一种或至少两种的组合，优选为苯基。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)所述疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值为5.5-6.5，样品体积流速为4-20MV/分钟，样品缓冲液浓度为20-80mM；

优选地，步骤(5)所述疏水层析膜色谱的洗脱条件为：洗脱液pH值6.5-7.5，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟，洗脱液盐浓度25mM-1M。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法具体包括以下步骤：

(1)利用pH值为6.5-8.5的缓冲液Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解，在0-10℃下搅拌1-8小时，而后在3000-8000转/分钟的转速下离心20-60分钟去除沉淀，得到溶解液；

(2)向步骤(1)所得溶解液中加入PEG，调节pH值至5.0-5.6，在0-10℃下搅拌1-4小时，3000-10000转/分钟的转速下离心20-60分钟，去除沉淀，取上清液；

(3)利用孔径为0.08-0.8μm的微滤膜将步骤(2)得到的上清液进行微滤；

(4)将步骤(3)所得滤液经过阴离子交换膜层析吸附α1-抗胰蛋白酶，而后利用洗脱液进行洗脱，收集含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液；

所述阴离子交换层析的上样条件为：样品pH值5.5-7.5，样品体积流速为4-20MV/分钟，样品缓冲液浓度为20-80mM；洗脱条件为：洗脱液pH值6.5-7.5，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟，洗脱液盐浓度25mM-1M；

(5)利用疏水层析膜色谱对步骤(4)所得含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液进行进一步纯化；

所述疏水层析膜色谱的上样条件为：样品pH值为5.5-6.5，样品体积流速为4-20MV/分钟，样品缓冲液浓度为20-80mM；洗脱条件为：洗脱液pH值6.5-7.5，洗脱液体积流速为4-20MV/分钟，洗脱液盐浓度25mM-1M；

(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、灭活、除菌、冻干得到所述α1-抗胰蛋白酶。