[发明专利]一种利用膜层析技术纯化α1-抗胰蛋白酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物材料分离纯化技术领域，涉及一种利用膜层析技术纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。

背景技术

α1-抗胰蛋白酶(α1-antitripsin，AAT)是血浆中主要的蛋白酶抑制剂，占血浆总蛋白酶抑制能力的90％以上。它能抑制多种丝氨酸内切肽酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、胰蛋白酶、血浆素、凝血酶等，其主要作用是保护机体正常细胞和器官不受蛋白酶的损伤，抑制感染和炎症，维持机体内环境的平衡。血浆中的α1-AAT主要由肝脏产生，其它如肠、肾、脾等也能产生少量的α1-AAT，这些肝外合成的α1-AT在局部组织损伤的调节中起重要作用。

AAT的制备主要是从血浆沉淀CohnIV出发，加入大量缓冲液以充分溶解蛋白，并降低其中的乙醇浓度以稳定目标蛋白，最后经PEG沉淀除去脂蛋白，所得蛋白料液中AAT浓度约为0.1mg/mL，含有一定量的杂蛋白，需要进一步的纯化。CN1900107A采用阴离子交换柱层析的方法进行纯化，CN102993298A采用阴离子交换层析和阳离子交换层析两步柱层析的方法进行纯化，CN102180966A采用两步阴离子交换柱层析方法进行纯化，CN101747432A和CN101275956A采用阴离子交换柱层析和分子筛层析两步层析的方法进行纯化。可见在α1-抗胰蛋白酶的纯化过程中，层析是一种主要的纯化手段，但是目前的层析过程均采用的是柱层析，存在着流速低，压降大，扩散传质阻力大，缓冲液消耗量大，蛋白容易失活等缺点。

因此，在本领域亟需一种更加高效的纯化α1-抗胰蛋白酶的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用膜层析技术纯化α1-抗胰蛋白酶的方法，该方法减少了聚集体，降低乙醇对目标蛋白活性的影响，并且缩短了单元操作时间，减少了缓冲液用量，是一种高效经济的蛋白纯化手段。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种α1-抗胰蛋白酶的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：

(1)将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解；

(2)向步骤(1)所得溶解液中加入PEG进行沉淀，取上清液；

(3)将步骤(2)得到的上清液进行微滤；

(4)将步骤(3)所得滤液经过阴离子交换膜层析吸附α1-抗胰蛋白酶，而后利用洗脱液进行洗脱，收集含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液；

(5)利用疏水层析膜色谱对步骤(4)所得含有α1-抗胰蛋白酶的洗脱液进行进一步纯化；

(6)对步骤(5)所得流穿液进行超滤、除菌、冻干得到所述α1-抗胰蛋白酶。

在α1-抗胰蛋白酶的纯化过程中，为减少聚集体和降低乙醇对目标蛋白活性的影响，从体积较大的蛋白料液中快速捕获并分离α1-抗胰蛋白酶对保持其稳定性尤为关键。现有技术中柱层析是蛋白分离纯化的主流工艺，其以扩散为主的传质方式并不适用于处理本料液体系，特别是高流速带来的高反压不利于整个纯化流程。而本发明利用的膜色谱技术融合了柱层析高选择性和膜过滤高通量的特点，以对流为主的传质方式使得膜色谱可以直接、快速捕获微量目标蛋白，能较好地满足当前的纯化需求。并且本发明结合使用阴离子交换膜层析与疏水层析膜色谱，可以提高对α1-抗胰蛋白酶的纯化效率，提高其纯度，并且可以保障α1-抗胰蛋白酶的活性，获得高活性α1-抗胰蛋白酶。

在本发明所述纯化方法中，步骤(1)使用缓冲液将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解。

优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液、Tris缓冲液或醋酸缓冲液中的任意一种，优选为磷酸缓冲液。

优选地，所述缓冲液的pH值为6.5-8.5，例如6.5、6.7、6.9、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4或8.5，优选7.0。

优选地，使用缓冲液将Cohn法组份Ⅳ沉淀溶解后，在0-10℃(0℃、2℃、4℃、6℃、8℃或10℃)下搅拌1-8小时(例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时)，而后离心去除沉淀，得到溶解液。

优选地，所述离心转速为3000-8000转/分钟，例如3000转/分钟、3500转/分钟、4000转/分钟、4500转/分钟、5000转/分钟、5500转/分钟、6000转/分钟、6500转/分钟、7000转/分钟、7500转/分钟或8000转/分钟，优选5000转/分钟。

优选地，所述离心时间为20-60分钟，例如20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟或60分钟，优选30分钟。