[发明专利]一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法

权利要求书

1.一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采集广西越桔植株上表面呈现绿色、表皮坚硬的未成熟果实，消毒后，用解剖刀切开未成熟果实，剥取未成熟种子连同部分子房组织，接种到培育培养基上；于25°C黑暗条件下培养24 h，再在光照强度为20 μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天的弱光照条件下培养，直到种子成熟；其中，培育培养基以WPM（Woody Plant Medium）为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白，蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白的浓度分别为0.03 g/mL、0.012 g/mL、0.002g/mL、0.0004 g/mL、0.0005 g/mL，pH为5.0；

（2）种子发育成熟后，将种子转移至萌发培养基上进行诱导萌发，培养条件：温度为25°C、光照强度为20 μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；

（3）种子萌发后，将幼苗转移到生长培养基上进行壮苗培养，并且可以通过扩繁培养基诱导其腋芽生长，进行大量扩繁；壮苗后将植株转移至生根培养基上进行生根培养，培养条件：温度为25°C、光照强度为50 μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；

（4）待植株生根后，将其炼苗后转移至营养土中栽培，栽培条件：温度为22°C、光照强度为50 μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天。

2.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（1）中，所述消毒程序为：①在1L水中加入5ml洗洁精，得到洗洁精水；将未成熟果实在洗洁精水中浸泡清洗20分钟；②用自来水冲洗浸泡过的果实2个小时；③在超净工作台上，将冲洗后的未成熟果实在体积分数为75%的乙醇水溶液中浸泡30秒，浸泡后用无菌水冲洗果实3次，每次1分钟；④用质量体积比为0.1%的升汞水溶液浸泡消毒10分钟，期间摇动3-5次，消毒结束后用无菌水冲洗5次，每次1分钟；⑤将冲洗后的果实置于无菌滤纸上，将果实表皮上多余的水分吸干。

3.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（1）中，所述未成熟种子剥取方法为用灭菌解剖刀切除果实上下两端各0.3cm，然后纵向切开，左手持镊子夹住果实外皮，右手持解剖刀将未成熟种子及部分子房组织取下。

4.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（1）中，所述未成熟种子的种皮表面呈浅黄褐色，所述成熟种子的种皮表面呈现深棕褐色。

5.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（2）中，所述萌发培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤和赤霉素组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤、赤霉素的浓度分别为0.03 g/mL、0.012 g/mL、1×10^-6g/mL、1.5×10^-6 g/mL，pH为5.0。

6.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（3）中，所述生长培养基由WPM、蔗糖、琼脂组成，蔗糖、琼脂的浓度分别为0.03 g/mL、0.012 g/mL，pH为5.0。

7.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（3）中，所述扩繁培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤的浓度分别为0.03 g/mL、0.012 g/mL、2×10^-6 g/mL，pH为5.0。

8.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（3）中，所述生根培养基由WPM、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸组成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸的浓度分别为0.03 g/mL、0.012 g/mL、1×10^-6 g/mL，pH为5.0。

9.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤（4）中，所述营养土由草炭和蛭石组成，草炭和蛭石的质量比为3：1。