[发明专利]一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法

权利要求书

1.一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，4种辣椒病毒为黄瓜花叶病毒CMV、辣椒轻斑驳病毒PMMoV、蚕豆萎焉病毒BBWV和烟草花叶病毒TMV，其特征在于通过以下步骤实现：

(1)提取植物总RNA

取0.1g新鲜或冷冻的待测辣椒样品在液氮中研磨至粉末，采用植物总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提RNA产物加入DEPC-ddH₂O溶解，-70℃保存备用；

(2)cDNA的合成

以提取的待测辣椒样品的总RNA为模板，反转录制备cDNA模板，反转录体系为20μL包括：RNA模板2μL，2.5mmol/L的dNTPs 2μL，10μmol/L的随机引物2μL，10×RT mix 2μL，QuantReverse Transcriptase 2μL，RNase-free ddH₂O 10μL，反应条件：37℃，60min；

(3)多重PCR扩增

以合成的cDNA为模板，采用下列4对引物进行多重PCR扩增，得到扩增产物；

第1对引物：CMV-F/CMV-R

CMV-F：5′-AGTCCGTAAAGTTCCTGC-3′，CMV-R：5′-TCATGTCGCCAATATCA-3′；

第2对引物：PMMoV-F/PMMoV-R

PMMoV-F：5′-AGAACTCGGAGTCATCGGAC-3′，PMMoV-R：5′-GAGTTATCGTACTCGCCACG-3′；

第3对引物：BBWV-F/BBWV-R

BBWV-F：5′-AAATATTAAAACAAACAGCTTTCGTT-3′，BBWV-R：5′-TTCAAAGCTCGTGCCATNTYATTKGC-3′；

第4对引物：TMV-F/TMV-R

TMV-F：5′-AGTTGTTGATGAGTTCATGGA-3′，TMV-R：5′-GAGGGAAAAACACTATGCGTTATC-3′；

(4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物

取5μLPCR产物在浓度为15g/L的琼脂糖1×TAE缓冲系统电泳，EB染色后，使用凝胶成像系统观察并摄影记录结果，根据电泳条带图判定病毒种类，若扩增产物中出现170bp大小的条带，则样品中含有CMV；若扩增产物中出现576bp大小的条带，则样品中含有PMMoV；

若扩增产物中出现390bp大小的条带，则样品中含有BBWV；若扩增产物中出现796bp大小的条带，则样品中含有TMV；所述四对引物在PCR反应体系中的终浓度分别为CMV-F/R 0.2μM，PMMoV-F/R 0.2μM，BBWV-F/R 0.1μM，TMV-F/R 0.4μM；所述多重PCR扩增反应体系为50μL：包括反转录产物1.0μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L的Mg²⁺ 3.0μL，10μmol/L的引物CMV-F、CMV-R各1.0μL，10μmol/L的引物PMMoV-F、PMMoV-R各1.0μL，10μmol/L的引物BBWV-F、BBWV-R各0.5μL，10μmol/L的引物TMV-F、TMV-R各2.0μL，2.5mmol/L的dNTPs 2.0μL，2.5U/μL的Taq DNA聚合酶0.6μL，无菌ddH₂O 31.9μL。

2.如权利要求1所述的一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45sec，54℃退火45sec，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸10min。