[发明专利]一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法

说明书

本发明涉及一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT‑PCR方法，属病毒检测领域。本发明针对4种病毒核苷酸保守区序列设计并合成了特异性引物对CMV‑F/R，PMMoV‑F/R，BBWV‑F/R，TMV‑F/R，并对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立能从辣椒组织中同时检测CMV，PMMoV，BBWV和TMV四种病毒复合侵染田间样品的检测方法。本发明提供的多重RT‑PCR检测方法，能够快速、准确又简便和经济的检测出辣椒带毒情况，以便尽早采取有效防治措施，对控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义。

技术领域

本发明涉及植物病毒检测技术领域，具体涉及一种快速检测4种辣椒病毒的多重RT-PCR方法。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L.)属茄科辣椒属植物，是一种重要的蔬菜作物，不仅可鲜食，还可以加工成各种辣椒产品。由于辣椒种植的经济效益和社会效益好，目前辣椒已成为我国播种面积第二大的蔬菜作物，年栽培面积约133万hm²。但是由于各种病害的影响，我国辣椒的单产相对较低。辣椒病毒病是我国辣椒生产中的首要病害。近年来，全国各辣椒种植区病毒病发生日益严重，成为影响辣椒产量和品质的重要因素。目前世界各地已发现有45种植物病毒能侵染辣椒，多数国家以CMV和TMV发生较普遍。我国已报到的侵染辣椒的病毒毒原主要有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、烟草花叶病毒（Tobaccomosaic virus, TMV）、蚕豆萎蔫病毒（Broad bean wilt virus, BBWV）、番茄花叶病毒（Tomato masaic virus, ToMV）、辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus, PMMoV）、辣椒轻驳病毒（Pepper mottle virus, PePMoV）等。其中CMV、PMMoV、BBWV及TMV在我国辣椒产区普遍存在，且常常复合侵染。辣椒病毒病的防治是世界性难题，尽管药剂处理、控制传病介体等方法具有一定减轻和延缓发病的作用，但无法根除。要从根本上解决辣椒病毒的防治问题必须采取有效的预防措施，严格对种苗进行检疫检验和脱毒处理，从源头上杜绝病原，而建立和应用先进的病原检测技术是，是有效控制和预防辣椒病毒病大发生，从而减少经济损失的最有效手段。

分子生物学检测是从核酸水平检测病毒，灵敏度高，特异性强，能克服血清学及其他检测方法中的一些缺点，在大批量的样本检测中较为适用，是目前最具应用前景的病毒检测技术。如RT-PCR技术、核酸杂交技术、双链RNA（dsRNA）电泳技术、环介导等温扩增技术等在病毒检测中的应用日趋广泛。单重RT-PCR是目前应用最广泛的病毒分子生物学检测方法，具有灵敏、快速、特异性强等优点，但单重RT-PCR一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用高，耽误时间。近些年逐渐发展起来的多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction)，其优点是可以在一种样品中同时鉴别多种病毒，并将PCR的敏感性和快速性结合起来，避免了逐一扩增待测样品中每种病原的麻烦，可提高诊断的敏感性，同时降低检测费用，逐渐被广泛用于病毒病的检测工作中。

目前CMV、PMMoV、BBWV及TMV已建立了单重RT-PCR分子检测技术，但尚未见这4种重要辣椒病毒的多重RT-PCR检测方法的报道。建立稳定灵敏的多重RT-PCR技术，实现在同一反应管中同时对CMV、PMMoV、BBWV及TMV四种病原进行鉴别检测，可提高检测准确性，缩短检测周期，降低检测成本。对于病毒病害的早期准确诊断，种子的检疫检验，从源头上杜绝病原，高效防控辣椒病毒病的发生蔓延具有重要作用。

发明内容