[发明专利]长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法及其使用的锈菌菌液

说明书

技术领域

本发明涉及作物抗病育种技术领域，尤其涉及室内离体鉴定长豇豆种质材料锈病 抗性的方法。

背景技术

豇豆(VignaunguiculataL.Walp)起源于非洲，隶属豆科(Fabaceae)菜豆族 (Trib.PhasoleaeDC.)豇豆属(VignaSavi)，是世界上特别是热带、亚热带地区重要的豆 类作物之一。目前全球豇豆种植面积在1500万公顷以上(http://www.fao.org/ statistics/yearbook)。栽培豇豆为自花授粉二倍体，基因组大小约630Mb(Arumuganathan andEarle1991)，包括两个栽培亚种，普通豇豆(ssp.unguiculata)和长豇豆 (ssp.sesquipedialis)。前者主要分布在非洲、中东地区、印度和美国南部地区，以成熟籽 粒作粮食和饲料用；后者主要分布在亚洲东部和南部地区，以幼嫩果荚作菜用。我国是长豇 豆的主要生产和消费国之一，年栽培面积约占世界的1/5。

由豇豆属单胞锈菌(Uromycesvignae)引起的锈病是长豇豆生产上普遍发生的一 种病害，严重威胁到我国长豇豆的产量和品质。该病在全世界豇豆生产区均有发生，主要危 害豇豆叶片和豆荚，发病叶片上密布针尖状黄色或黑色疱斑，破裂后散发出锈粉状孢子，锈 菌孢子可随风传播造成重复侵染，叶片逐渐枯黄、衰落，造成植株生长势衰弱，采收期缩短。 锈病在田间发病率高，特别是在低温多雨潮湿的环境下容易大面积暴发，华北地区7～8月 份是豇豆锈病盛发期，南方地区则在5～10月份均有锈病危害。豇豆锈病是气传病害，很难 用化学防治和生物防治等手段根除，选育抗病品种是防治豇豆锈病最经济有效的方法。获 得抗锈病种质资源、挖掘抗病基因是抗锈病育种的前提和基础，而准确可靠的抗锈病鉴定 技术是实现这一目标的关键。目前对豇豆锈病的鉴定主要采用田间自然鉴定和接种鉴定的 方法，通过田间自然发病或人工喷施锈病孢子悬浮液接种，发病后调查叶片上的孢子个数， 据此进行分级，最后根据各株系的病情指数评价其抗锈病的能力，这种方法虽然简单、快 速，但受田间气候变化的影响较大，接种成功与否均难以控制，且调查时分级困难，鉴定结 果的准确性也无法保证。为了提高抗锈病鉴定的准确性，在小麦、大豆上相继建立了离体叶 片鉴定的方法，但在长豇豆上，尚无锈病离体鉴定的方法与技术。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定的锈菌菌 液，本发明的第二个目的是提供采用上述的锈菌菌液进长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方 法，该方法首先通过单孢子分离获得纯化的单一锈菌株系，通过在离体叶片上接种浓度和 数量相同的新鲜孢子悬浮液，在可控的环境下观察锈病孢子的生长情况，根据孢子的生长 状况评价种质的抗锈病能力。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定的锈菌菌液，该锈菌菌液的制备方法如 下：

1)从田间采集感锈病的叶片，用含0.1％Tween-20的蒸馏水清洗病叶上的锈病孢 子，镜检后调整孢子浓度至10²/ml，将此菌液接种在感病品种‘之豇282’生长10天的幼嫩叶 片上，每片叶子接4-6个点，每个点接10μl菌液，接种后将培养皿置于光照培养架上，光照强 度为80-100μmol/m²/s，温度在25℃，光周期16/8h，保持培养皿内滤纸湿润，培养7-10天；

2)选择步骤1)中‘之豇282’叶片上出现的单个孢子堆，用牙签将之接种在新的‘之 豇282’叶片上，利用步骤1)相同方法将孢子扩繁2-3次，最后获得的即为纯化的锈菌株系， 编号为Auv-1锈菌；Auv-1锈菌应始终保存在活体的‘之豇282’叶片上，在前一批叶子枯黄 前，将之转移至新鲜的叶子上；

3)将Auv-1锈菌在‘之豇282’叶片上大量扩繁，利用含0.1％Tween-20的蒸馏水清 洗孢子，用4层纱布过滤菌丝后制成10⁵/mL孢子悬浮液。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种长豇豆种质锈病抗性的离体鉴定方法，该方法包括以下的步骤：