[发明专利]实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法

权利要求书

1.一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，其特征在 于，依次包括下述步骤：

1)引物的稀释

每管加超纯水0.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶 解，于-20℃冰箱保存备用；

2)样品的前处理

取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离 心管中；

3)DNA的提取

样品的裂解：取前处理好的样品，加入400μl裂解缓冲液和已 融化的核糖核酸酶A5μl，振荡混匀；置于70℃金属浴中10-30 分钟，期间取出振荡混匀数次；5000转离心10分钟，取上清进行提 取；

4)磁珠法提取样品DNA

取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μ l，连接缓冲液600μl，磁珠60μl；F行加入清洗缓冲液Ⅰ500μl； G行加入清洗缓冲液Ⅱ550μl；H行加入清洗缓冲液Ⅲ550μl；取 出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μl；将混合后的96位深孔 板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取；

5)PCR反应液的配制

每管PCR管中分别加入2x荧光定量预混试剂彩色版10μl、 正、反引物各0.5μl及无RNA酶ddH2O7μl；往上述含有反应液 的PCR管中加入2μl提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使反应 液与DNA混匀，并经3000转离心3～10秒，立即进行PCR反应；

6)设置荧光定量PCR仪反应参数如下：95℃、4min1个循 环；95℃、30s，60℃，30s，72℃，60s，45个循环，采集荧光；

7)数据处理

将数据同步至电脑上，选择“定性检测”对试样进行分析。

2.根据权利要求1所述的一种实时荧光定量PCR对川贝母的 鉴别方法，其特征在于，所述的荧光定量PCR仪设置方法：检测模 式为荧光通道，反应总体积为20μl，染色选择荧光染色I，依次选 择预变性和三步扩增，收集荧光。