[发明专利]实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法

说明书

技术领域

本发明提供一种对川贝母的鉴别方法，具体的说，实时荧光定 量PCR对川贝母的鉴别方法；属于化学检测技术领域。

背景技术

川贝母主要分布于四川、云南、西藏等地，品质较优，为百合 科植物川贝母、棱砂、乌花等的鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳的 功效，药用价值较高。传统的川贝母的鉴别，主要是性状、显微鉴 别、光谱法，由于市场上贝母类药材品种较多，相同品种间也会因 为药源植物来源不一、种植环境、产地和加工等因素存在相当的混 杂度,这就使得实验人员必须具备较高的药材鉴别经验。随着分子生 物学技术的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为可能。目前 文献上已有聚合酶链式反应(PCR)法鉴别川贝母药材的相关报 道。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种通过磁珠法提取川贝 母中的DNA，利用PCR荧光探针法来鉴别，较普通PCR法操作简 单、时间短、准确率高、环保。

一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方法，依次包括下述步 骤：

1)引物的稀释

每管加超纯水0.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶 解，于-20℃冰箱保存备用；

2)样品的前处理

取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离 心管中；

3)DNA的提取

样品的裂解：取前处理好的样品，加入400μl裂解缓冲液和已 融化的核糖核酸酶A5μl，振荡混匀；置于70℃金属浴中10-30 分钟，期间取出振荡混匀数次；5000转离心10分钟，取上清进行提 取；

4)磁珠法提取样品DNA

取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μ l，连接缓冲液600μl，磁珠60μl；F行加入清洗缓冲液Ⅰ500μl； G行加入清洗缓冲液Ⅱ550μl；H行加入清洗缓冲液Ⅲ550μl；取 出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μl；将混合后的96位深孔 板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取；

5)PCR反应液的配制

每管PCR管中分别加入2x荧光定量预混试剂彩色版10μl、 正、反引物各0.5μl及无RNA酶ddH2O7μl；往上述含有反应液 的PCR管中加入2μl提取好的DNA，轻轻敲打PCR管盒，使反应 液与DNA混匀，并经3000转离心3～10秒，立即进行PCR反应；

6)设置荧光定量PCR仪反应参数如下：95℃、4min1个循 环；95℃、30s，60℃，30s，72℃，60s，45个循环，采集荧光；

7)数据处理

将数据同步至电脑上，选择“定性检测”对试样进行分析。

进一步的，上述的一种实时荧光定量PCR对川贝母的鉴别方 法，所述的荧光定量PCR仪设置方法：检测模式为荧光通道，反应 总体积为20μl，染色选择荧光染色I，依次选择预变性和三步扩 增，收集荧光。

与现有技术相比，由于传统的DNA提取多以试剂法提取，常因 步骤多，往往提取效率不高，以影响结果准确性；本发明采用磁珠 法进行DNA提取，具有专属性强、富集效率高、操作相对简单等特 点。

本发明对实时荧光定量PCR判定原则为无Cq值，曲线为直线 或轻微斜线，无明显指数增长期，可判为非川贝母；Cq≤30，曲线 有明显指数扩增期，可判为川贝母。

本发明建立了用实时荧光定量PCR来鉴别川贝母，对5批川贝 母和3批其它贝母类进行了测试，通过Cq值和扩增曲线图来判断， 直观明了，准确率100％，并经多次重复试验，重现性好。说明该方 法对于鉴别川贝母专属性强，可行性高，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是川贝母对照药材、川贝母、阳性对照的qPCR检测结 果。

图2是非川贝母类(平贝母、浙贝母和土贝母)、阴性对照的 qPCR检测结果；

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细 说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护 范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

1.材料与仪器

1.1药材