[发明专利]结肠癌细胞的体外拟组织化培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物细胞的体外培养方法，特别地，涉及一种结肠癌细胞的体外组织化培养方法；涉及一种用于功能性成分研究的Caco-2细胞中空纤维反应器的构建方法。

背景技术

Caco-2细胞是人源结肠腺癌细胞，其同源性好，生命力强，经过3周左右的培养后，可形成连续的细胞单层，并在形态和功能上分化出接近成熟小肠上皮细胞的状态^[1]，也相应表达出小肠的水解酶(如麦芽糖酶、乳糖酶、氨基肽酶等)的作用。

作为附着依赖性细胞，单层贴壁培养模型是Caco-2细胞最常见的培养模型。为了改善极性细胞培养情况，研究者们将Caco-2细胞培养在覆有透过性微孔滤膜的插入式嵌套培养板上。被培养在半透性滤膜上的Caco-2细胞单层将整个培养体系分成了顶膜侧(apicalside)和底膜侧(basolateralside)，化学物质由顶膜侧进入体系，通过检测基底膜侧被测物质的浓度即可进行物质吸收、转运及代谢的研究^[2]。较为经典的产品有等。

尽管单层模型具有操作简便、重复性好和成本低等优点，但由于接触抑制原理，此法很难大规模培养细胞。单层模型属于二维培养模型，它无法为细胞研究提供类似于体内的微环境，造成细胞形态和信号传导结果与体内有较大差异。研究中发现，传统的单层细胞模型培养的细胞需要21天的培养才能够充分分化并且表达出较为接近人体小肠上皮的功能，无疑增加了人力、物力和时间的投入。近年来，研究者们通过采用多种细胞混合培养、反应器构建、生物材料表面改性等方法来优化Caco-2细胞模型。

Tapia等人^[3]将Caco-2细胞与浓度为1.2％的藻朊酸盐(alginate)溶液封装(encapsulate)混合培养在搅动型生物反应器中，通过台盼蓝染色观察和检测乳酸的产生和葡萄糖的消耗来评价细胞的生长和代谢状态。研究结果表明，用藻朊酸盐封装Caco-2细胞并通过悬浮搅动培养的方法具有一定的可行性，但仍需要通过大量实验来优化生物反应器的设计从而获得更具竞争力的细胞产出。Piana等人^[4]通过亲疏水改性材料来研究其对Caco-2细胞粘附生长的影响。研究发现亲水改性的材料有助于细胞的贴附生长，但疏水材料表面上生长的细胞的刷状缘酶系的表达水平相对升高。

在生物反应器构建方面，三维动态构型在模拟小肠上皮的微环境方面显得更有优势。本发明所使用的中空纤维是一种微滤膜材料制成的细微管状结构，管壁是极薄的半透膜。每根纤维具有很高的比表面积，其构造类似于动物的毛细血管，可以为贴壁细胞提供类似体内的微环境^[5]。中空纤维膜上的微孔结构使离子和营养物质可以穿过膜到达细胞单层的两侧，避免了培养液流动而产生的不良应力影响，从而使细胞以更为自然的方式进行代谢。同时，通过中空纤维膜构建的细胞培养环境温和，培养细胞密度较高(107～108个细胞/mL)^[6]。

Caco-2细胞模型常被应用于口服药物的摄取、吸收转运以及毒性研究^[7_,^8]，近年来也被大量应用于氨基酸、核苷、微量元素等营养素的小肠吸收机理研究^[9]，以及丙烯酰胺等毒性成分的研究^[10]。研究中发现，传统的单层细胞模型与正常肠道存在较大差异，而采用中空纤维构建的生物反应器在形态上更为接近小肠的管腔结构，可以为Caco-2细胞提供大量中空纤维间的孔隙作为生长空间，增加了Caco-2细胞与培养基的接触面积，有利于物质交换^[11]，进而可以缩短细胞的培养分化周期，从而可以更好地应用于口服药物以及功能性成分的小肠吸收机制研究。

参考文献：

[1]PintoM,Robing-LeonS,AppayMD,etal.Enterocyte-likedifferentiationandpolarizationofthehumancoloncarcinomacelllineCaco-2inculture.BiologyoftheCell,1983,47(3):323-30(PintoM,Robing-LeonS,AppayMD,等.人体结肠癌细胞系Caco-2细胞在培养中的肠状分化与极化.细胞生物学,1983,47(3):323-30.)；