[发明专利]一种改良的蛋白质印迹方法

说明书

技术领域

本申请涉及生命科学研究领域，具体地涉及改良的蛋白质印迹实验技术。

背景技术

蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即WesternBlot，是分子生物学、生物化 学和免疫遗传学中常用的分析方法，并且是一种能对蛋白进行定性和半定量 的分析的方法。蛋白免疫印迹是一种蛋白质检测技术，主要涉及将电泳分离 后的从细胞或组织提取的蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜 上，然后用特异性抗体检测某特定抗原，其基本原理是通过特异性抗体对凝 胶电泳处理过的已分离的蛋白质进行着色，通过分析着色的位置和着色深度 获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息(参见图1)。

蛋白质印迹法现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检 测和疾病早期诊断等多个方面。蛋白质印迹法可分为电泳、转膜、酶免疫反 应，二抗上的酶底物反应产生信号和蛋白信号检测五个阶段。蛋白质印迹法 的灵敏度主要依赖于最终的信号放大与信号检测，总体可分为两种，即酶促 反应和同位素标记放射自显影。其中，放射自显影所用试剂有辐射性；经典 蛋白质印迹法中，对二抗偶联的酶和底物的信号检测方式包括：

底物呈色:(二抗用HRP标记)HRP的生色底物有二氨基联苯胺 (3,3-diaminobenzidine，DAB)、氯萘酚(4-chloro-1-naphthol，4-CN)、CN/DAB、 3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazol，AEC)和四甲基联苯胺 (3,3,5,5tetramethylbenzidine，TMB)等(而得到可溶性产物的底物如OPD、 ABTS等则适用于ELISA)中，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化 氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测蛋白质印迹法的结 果；

经典增强化学发光法(ECL)(二抗用HRP标记)：反应底物为过氧化物 +鲁米诺，如遇到HRP，酶促基团发光，结果通过X光片压片使胶片曝光后 洗出条带而显影；

底物荧光ECF：反应底物为过氧化物和鲁米诺，经HRP催化发生化学反 应。

底物DAB显色方法的缺点缺陷就是需要现配现用，显色后光照数小时会 褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒；传统的ECL采用X光片检 测酶和底物反应产生的化学发光，该方法需要通过显影和定影两步过程才能 实现最终对蛋白的显色。这种方式需要根据信号强弱调整曝光时间，还需要X 光片及显影液，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间，因此操作繁 琐，有放射性污染的风险，而且不易掌握，成本较高。

表1.经典蛋白质印迹法中，HRP的不同生色底物(可参见 http://www.biofly.cn/view.asp？id＝44)

因此，现代生命科学研究领域亟待一种灵敏度高、操作简单的影像获取技 术代替现有蛋白质印迹法的影像显示，改良蛋白质印迹法的操作以降低生命 科学科研人员的劳动强度。

发明内容

本申请提供了一种改良的蛋白质印迹方法，包括以下步骤：(1)目标蛋 白质的SDA-PAGE电泳分离；(2)转膜；(3)酶免疫定位；(4)蛋白信 号检测；其中，步骤(3)所述的酶免疫反应是膜上的目标蛋白质先后分别与 特异性一抗和酶标二抗发生反应，所述酶标二抗是偶联酶标记物的特异性一 抗的抗体；并且所述酶标二抗的酶标记与显色底物反应产物产生荧光，所述 步骤(4)是采用活体生物成像装置检测步骤(3)产生的荧光信号。在一些 实施方案中，所述步骤(4)中采用活体生物成像装置检测的曝光时间为 0.025s～2.5s，优选0.25s。在一些实施方案中，所述酶标记物选自辣根过氧化 物酶和碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶β中的一种。在一些实施方 案中，所述酶标记物是辣根过氧化物酶。在一些实施方案中，所述与酶标二 抗上偶联的酶标记的反应底物包括但不限于DAB、4-CN、CN/DAB、AEC、 TMB和ECL。在一些实施方案中，所述酶标二抗的偶联酶标记的反应物底物 是ECL。在一些实施方案中，所述目标蛋白质包括动物蛋白。在一些实施方 案中，步骤(2)中所述转膜是将在凝胶中已经分离的条带转移至固相膜上， 所述固相膜选自硝酸纤维素膜(NC)和PVDF膜中的一种。在一些实施方案中， 步骤(4)所述的活体生物成像装置为荧光成像装置，优选小动物活体成像仪。