[发明专利]检测利巴韦林的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测利巴韦林的酶联免疫试剂盒，可定性、定量检测动物组织中利巴韦林药物的残留量。

背景技术

利巴韦林(RBV，病毒唑)为一种高效广谱抗病毒的核苷类药物，对多种DNA和RNA病毒均有较好的抑制作用，具有作用位点多、疗效高、毒性低、不易产生耐药性和副作用少等特点，现已用于多种病毒的治疗。在临床上对流感、各种呼吸道合孢病毒、病毒性肝炎、人免疫缺陷性病毒和流行性出血热的治疗有较高疗效。但是该类药物易产生耐药性，使病毒发生变异，长期使用对机体细胞产生毒害作用，其对人体产生的最突出的安全性问题是溶血性贫血、遗传毒性、生殖毒性和致癌性等。

农业部于2005年先后颁布的农业部第560号公告《兽药地方标准废止目录》及农医发[2005]33号文件《关于清查金刚烷胺等抗病毒药物的紧急通知》中，均明确规定“禁止金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、吗啉(双)胍(病毒灵)、利巴韦林等及其盐、酯的单、复方等制剂生产、经营和使用。违者按生产、经营假兽药和使用禁用兽药处理，依照《兽药管理条例》予以处罚”。

目前国内外均无动物源性食品中利巴韦林残留测定的标准方法。由于动物源性食品基质复杂，在提取净化测定过程中可能对利巴韦林造成干扰。另外，利巴韦林是弱碱性的极性小分子，又为核苷类化合物，与组织中的一些内源性物质结构较为类似，给检测带来了一定的困难。目前文献报道的方法主要有放射免疫法、液相色谱法、气相色谱串联质谱法以及液相色谱串联质谱法等。这些方法检测的基体大部分是血液、药剂或兽药等，仅有少数文献报道了动物组织中利巴韦林残留的检测方法。仪器方法具有灵敏度高、结果准确等优点，但是资金和人员等投入成本较高。本发明应用酶联免疫法，测定动物组织中利巴韦林药物的残留量，具有检测限低、特异性强、操作简便、检测速度快、检测成本低，非常容易推广等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够检测动物组织中利巴韦林药物残留量的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、利巴韦林标准品溶液、酶标抗体、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为利巴韦林偶联抗原，所述酶标抗体为酶标记的利巴韦林抗体。

所述利巴韦林偶联抗原是由利巴韦林半抗原与载体蛋白偶联得到，所述利巴韦林半抗原 是经还原反应得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述利巴韦林特异性抗体是以利巴韦林偶联抗原作为免疫原制备获得，所述利巴韦林特异性抗体可为利巴韦林单克隆抗体或利巴韦林多克隆抗体，其中优选利巴韦林单克隆抗体。

所述酶标抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标抗体是由酶和利巴韦林抗体偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括利巴韦林标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述利巴韦林标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1～2mol/L的硫酸或液盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述复溶液优选为pH值为7.0、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1～7.5，含有1％～3％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/mL，每孔加入100μl，25℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，25℃避光孵育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：