[发明专利]一种有机整体小柱的制备及有机整体小柱和应用

权利要求书

1.一种有机整体小柱的制备方法，其特征在于：

具体步骤如下：

（1）配置甲醇与1, 4-丁二醇的混合溶液，其体积比为1:2-2:1；

（2）使用上述步骤（1）得到的甲醇/1, 4-丁二醇混合溶液配置二苯甲酮溶液，其质量体积分数为0.05 -0.20 g/mL；

（3）取上述步骤（2）中得到的二苯甲酮溶液5 μL-20 μL，加入到20 μL GE Loader Tip枪头内，置于紫外发生器中，于365 nm波长紫外光下照射反应5-20分钟；离心去除GELoader tip枪头内的二苯甲酮溶液；

（4）重复上述步骤（3）的过程1-4次；

（5）取2 μL-4 μL聚合液，加入到步骤（4）中准备好的GE Loader tip枪头内，置于紫外发生器（XL-1500 A, Spectronics公司, New York, USA）中，于365 nm波长下照射反应5-20分钟，得到磷酸基离心小柱；

聚合液溶剂的体积组成为：12%-15% EGMP（乙烯基乙二醇甲基丙烯磷酸酯）、40.0-49.0% DMSO（二甲基亚砜）、7.0-10.0% DMF（二甲基甲酰胺）、32.0-35.0%十二烷醇；溶质为0.05-0.20 g/mL Bis（亚甲基双丙烯酰胺）；

（6）配置40-60 mg/mL硫酸钛水溶液，加入到上述步骤（5）中制备好的磷酸基离心小柱内，4000-8000 g转速下离心反应10-20分钟，弃掉离心分离出的液体；重复上述操作过程2-4次；

（7）配置洗涤水溶液1，其中，乙腈的体积分数为20-40%、三氟乙酸的体积分数为0.1-0.3%、余量为水，在4000-8000 g转速下离心洗涤步骤（6）得到的小柱，弃掉离心分离出的液体；重复上述操作过程4-6次；

（8）配置洗涤水溶液2，其中，氯化钠的摩尔浓度为150-300 mM、余量为水，在4000-8000g转速下离心洗涤步骤（7）得到的小柱，弃掉离心分离出的液体；重复上述操作过程4-6次；

（9）用去离子水洗涤上述步骤（8）中的离心小柱，在4000-8000 g转速下离心洗涤，弃掉离心分离出的液体；重复上述操作过程4-6次，获得所需产物Ti (IV)-IMAC有机整体小柱。

2.一种权利要求1所制备的有机整体小柱。

3.一种权利要求2所述的有机整体小柱的应用，其特征在于：将有机整体小柱用于复杂肽段样品富集分析，具体步骤如下：

（1）配置上样缓冲水溶液，其中乙腈的体积分数为70-90%、三氟乙酸的体积分数为5-7%、余量为水；

（2）使用上述步骤（1）中的上样缓冲水溶液，酸化平衡Ti (IV)-IMAC有机整体小柱，离心弃掉其中的液体；重复上述操作过程2-4次；

（3）使用上述步骤（1）中的上样缓冲水溶液与复杂肽段样品混合，其体积比为1:2-2:1，并转移至Ti (IV)-IMAC有机整体小柱内，在4000-8000 g转速下离心富集，离心分离出的液体再次转移至Ti (IV)-IMAC有机整体小柱内；重复上述操作过程1-3次；

（4）配置洗涤水溶液1，其中，乙腈的体积分数为40-60%、三氟乙酸的体积分数为5-7%、氯化钠的摩尔浓度为150-300 mM、余量为水；在4000-8000 g转速下离心洗涤步骤（3）得到的小柱，弃掉洗涤液；重复上述离心洗涤操作过程1-3次；

（5）配置洗涤水溶液2，其中，乙腈的体积分数为20-40%、三氟乙酸的体积分数为0.1-0.3%、余量为水；在4000-8000 g转速下离心洗涤步骤（4）得到的小柱，弃掉洗涤液；重复上述离心洗涤操作过程1-3次；

（6）配置洗脱水溶液，其中氨水的体积分数为5-20%、余量为水；在4000-8000 g转速下离心洗涤步骤（5）得到的小柱，收集洗脱液；重复上述离心洗脱操作过程1-3次，合并洗脱液得产物。

4.根据权利要求3所述有机整体小柱的应用，其特征在于：

所述复杂肽段样品为细胞样品、血液样品或者组织样品中的一种或二种以上的蛋白质混合物的胰蛋白酶酶解液中的一种或二种以上。

5.根据权利要求3所述有机整体小柱的应用，其特征在于：应用于所述有机整体小柱可实现磷酸化蛋白质组学的分析，可获取相应的磷酸肽和磷酸化位点的鉴定结果，该结果可以用于翻译后修饰蛋白质组学分析。