[发明专利]一种有机整体小柱的制备及有机整体小柱和应用

说明书

本发明涉及一种Ti(IV)‑IMAC有机整体小柱的制备，并将其用于微量生物样品的磷酸化蛋白质组学分析。该有机整体柱材料是聚甲基丙烯酸酯类高聚物，含有丰富的孔结构，比表面积高，钛离子的富集活性位点多；与此同时，由于其亲水性的材料表面，在磷酸肽富集方面展现出了强大的富集能力。将其用于5g HeLa细胞的磷酸化蛋白质组学分析，平均鉴定到了超过1000个以上的非冗余磷酸化位点，且富集特异性高达92.5％。更重要的是，该Ti(IV)‑IMAC有机整体小柱制备简单，相比较填充小柱，它可以通过光诱导的自由基聚合反应仅需数分钟就制备完成；且无需进行塞子的制备，在很大程度上减少富集材料的准备时间。

技术领域

本发明属于蛋白质组学研究方向磷酸化蛋白质组学技术领域，具体涉及应用于磷酸化蛋白质组样品处理方法。

背景技术

作为重要的蛋白质翻译后修饰，蛋白质磷酸化在细胞代谢调节中发挥着至关重要的作用。异常的磷酸化修饰与许多疾病过程息息相关，例如恶性肿瘤等。目前基于鸟枪法的蛋白质组学分析策略是磷酸化蛋白质组学研究当中的主要方法。在这种方法中，蛋白质样品首先被酶解为多肽，通过磷酸肽富集之后，进行LC-MS/MS分析。由于磷酸化修饰的高度动态范围、磷酸化蛋白的低丰度以及磷酸化肽段较差的离子化效果，因此，影响整个磷酸化蛋白质组学分析的准确度以及灵敏度的关键步骤就是磷酸肽的特异性富集过程。

目前，固定化金属离子亲和色谱(IMAC)和金属氧化物亲和色谱(MOC)，是两种主要的磷酸肽富集手段，其中要属二氧化钛(TiO₂)和Ti(IV)-IMAC微球材料应用最为广泛。近些年来，填充离心小柱在微量磷酸化蛋白质组学分析中得到了广泛的应用，这是由于它具有操作自动化、样品损失少和无样品污染等优点。但是，该方法需要在离心小柱的尖端制备额外的塞子来对小柱进行封闭，以防止填充的材料溢出洒落。目前，脱脂棉和C8材料是两种主要用于塞子制备的材料，但是脱脂棉在样品处理过程中易吸收溶液，导致较高的离心负压，而C8材料易产生普通肽段的非特异性吸附(文献1.Zhu,J.et al.Centrifugationassisted microreactor enables facile integration of trypsin digestion,hydrophilic interaction chromatography enrichment,and on-columndeglycosylation for rapid and sensitive N-glycoproteomeanalysis.Anal.Chem.84,5146-5153(2012).文献2.Zhou,H.；Ye,M.et al.Robustphosphoproteome enrichment using monodisperse microsphere–based immobilizedtitanium(IV)ion affinity chromatography.Nat.Protoc.8,461-480(2013).)。