[发明专利]肉果草微卫星分子标记

权利要求书

1.一种肉果草微卫星分子标记，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10中任意一种或多种的核苷酸序列。

2.一种适于权利要求1所述分子标记的特异性引物，其特征在于采用下列任意一对或多对引物：

1)序列表中SEQ ID NO.11和12组成的引物对；

2)序列表中SEQ ID NO.13和14组成的引物对；

3)序列表中SEQ ID NO.15和16组成的引物对；

4)序列表中SEQ ID NO.17和18组成的引物对；

5)序列表中SEQ ID NO.19和20组成的引物对；

6)序列表中SEQ ID NO.21和22组成的引物对；

7)序列表中SEQ ID NO.23和24组成的引物对；

8)序列表中SEQ ID NO.25和26组成的引物对；

9)序列表中SEQ ID NO.27和28组成的引物对；

10)序列表中SEQ ID NO.29和30组成的引物对。

3.一种基于RAD-seq技术获取权利要求1所述的肉果草微卫星分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)肉果草DNA文库的构建：用CTAB法提取肉果草基因组DNA、通过限制性内切酶进行酶切、连接接头p1、随机打断、末端修复、加A尾、连接接头p2、PCR扩增、回收300-700bp序列和纯化，在Illumina HiSeq测序平台上进行双末端测序；

(2)测序数据质量控制：每端测序125bp，用Illumina Casava 1.8进行碱基识别，获得原始测序序列raw base，对其测序质量分布、测序错误率分布以及GC含量分布进行检查，得到clean base；

(3)RAD-Tag捕获率统计：统计clean base去重后reads中酶Tag开头的reads数，以及酶捕获的reads数目与去重后reads数目的比值，得到RAD-Tag相关统计信息；

(4)聚类与组装：对于样本中的含有酶识别位点reads，用cd-hit-est软件进行聚类，并从中选取reads支持数为10-400之间的类，根据聚类结果，用Velvetopt进行参数设置，对筛选后的类进行组装，组装后，对125bp以下的contig进行过滤；

(5)SSR检测：对于已经组装好的contig，用rimmomatic v.0.32软件进行SSR检测，SSR检测标准如下：SSR重复单元的最小长度为2bp、SSR重复单元的最大长度为6bp、SSR序列的最小长度为12bp、SSR上下游序列长度为100bp、两个SSR的最小距离为12bp；

(6)分离SSR引物：用Primer 3软件批量设计SSR引物，合成SSR引物，鉴定其在不同肉果草中的多态性，筛选出具有稳定性和多态性的引物。

4.一种利用权利要求2所述的引物分析肉果草遗传多样性的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)实验材料的准备：肉果草采样，并分别提取用于检测分析的每个个体的基因组DNA；

(2)PCR扩增：利用权利要求2所述的引物，以提取的不同个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，退火30秒，72℃延伸35秒，变性至退火三个步骤重复35次，最后72℃充分延伸8分钟，4℃保存；

(3)电泳检测：对PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，对于条带清晰的PCR产物用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测；

(4)结果分析：用genepop软件计算期望杂合度和观察杂合度，并计算近交系数，以此来描述肉果草相关微卫星DNA多态性的特征。

5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物在肉果草遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析和/或进化与亲缘关系研究中的应用。