[发明专利]肉果草微卫星分子标记

说明书

本发明涉及一种肉果草微卫星分子标记，属DNA分子标记技术领域，其通过RAD‑seq技术从肉果草基因组DNA中分离微卫星分子标记，根据每个微卫星分子标记位点两端的侧翼序列设计该分子标记的特异性引物，对来自不同居群的肉果草个体进行PCR扩增并检测扩增结果的稳定性和多态性，获得了10个有效的微卫星分子标记。本发明开发出有效的肉果草微卫星分子标记，建立了制备肉果草微卫星分子标记的方法，并可用这些分子标记进行遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等。

技术领域

本发明涉及一种生物科学中的DNA分子标记技术，尤其涉及一种肉果草微卫星分子标记、引物对及其制备方法和应用。

背景技术

微卫星分子标记又称作简单序列重复 (Simple Sequence Repeats, SSRs)，是指基因组中以1-6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。由于重复次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了微卫星序列长度的高度变异性，由此产生了微卫星分子标记。虽然微卫星位点核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，但是其两端侧翼序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用两端的侧翼序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方式显示这些分子标记在不同个体间的多态性。微卫星分子标记具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中；多态性信息容量高；呈共显性；遵循孟德尔遗传法则、中性选择等。基于以上特点，微卫星分子标记被广泛用于遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系等方面的研究。

肉果草（Lancea tibetica），藏名巴丫巴，隶属于玄参科肉果草属，分布于青藏高原及其毗邻山区（西藏、青海、甘肃、四川、云南及印属喜马拉雅地区等），生于海拔2000-4500米的草地、疏林中或沟谷旁。肉果草为重要的藏药植物，全草有养肺排脓、清热止咳功效，花、果能治疗心脏病、血性肿瘤（血癌）、哮喘、痛肿疮疡等。肉果草药理作用主要有如下几个方面：（1）有抗肿瘤作用；（2）有抗氧化作用；（3）有抗疟作用；（4）有抗真菌作用；（5）有杀菌作用；（6）具有降糖的作用；（7）具有保肝作用。由于其具有很重要的药用价值，肉果草已经吸引了很多国内外学者的关注。在与玉树等地的藏医交流中发现，肉果草作为一味十分重要的藏药材，有着较为广泛的应用。但由于对该物种的遗传背景等研究较少，难以开展人工种植，仅依靠野外采挖获取，加剧了该物种的濒危进程。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术尚未开发肉果草微卫星标记的现状，利用限制性酶切位点相关DNA的简化基因组测序（RAD-seq）技术开发出肉果草微卫星分子标记并获得对应的引物，建立一种制备肉果草微卫星分子标记的方法，并由此可以进一步用这些分子标记进行遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种肉果草微卫星分子标记，具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10中任一种或多种的核苷酸序列,这些分子标记所对应的位点分别编号为LT4、LT7、LT9、LT10、LT12、LT15、LT16、LT18、LT25、LT28。

适于本发明中任意一种或多种肉果草微卫星分子标记的特异性引物，具有序列表SEQ ID NO.11至SEQ ID NO.30中任一种或多种的核苷酸序列，各引物的特点及与微卫星分子标记（位点）的对应关系见表1。

表1 微卫星片段引物的特点及与微卫星分子标记（位点）的对应关系

一种基于RAD-seq技术获取本发明所述肉果草微卫星分子标记的方法，其包括以下步骤：