[发明专利]一种抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体及其制备方法

权利要求书

1.一种抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体，所述重组杆状病毒载体是把干扰昆虫细胞caspase-1表达的小RNA的基因和调控序列敲入到杆状病毒载体骨架上，制作出的能延长感染细胞存活期的重组杆状病毒载体，其特征在于，所述干扰昆虫细胞caspase-1表达的小RNA的基因是序列为SEQ ID NO.1的shRNA1、序列为SEQ ID NO.2的shRNA2和/或序列为SEQ ID NO.3的shRNA3。

2.根据权利要求1所述的抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体，其特征在于，所述的调控序列是U6启动子序列。

3.一种抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

(1)扩增并克隆U6启动子，构建表达载体pTriExU6；

(2)设计shRNA1、shRNA2和shRNA3，合成引物；

(3)用引物扩增的方法获得shRNA的基因片段；

(4)将shRNA的基因片段克隆到表达载体，获得表达质粒；

(5)用PCR方法扩增带U6-shRNA基因的反筛片段；

(6)将反筛片段与AcMNPV Bacmid共转化到含pRed/ET的大肠杆菌HS996菌株，筛选Bacmid_U6-shRNA；

(7)测序验证重组病毒载体的正确性。

4.如权利要求3所述的抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体的制备方法，其特征在于，设计了三段干扰昆虫细胞caspase-1表达的小RNA基因序列，这三段干扰RNA的基因序列为：

shRNA1:

GCTAGGATGCCAGTTGATAGATTAATAAGCTCTATCAACTGGCATCCTAGCAAAAA；

shRNA2:

GCTGTATGCCAAAGATACTCATTAATAAGCTGAGTATCTTTGGCATACAGCAAAAA；

shRNA3:

GCTAGACTTTGAGTCTAATGCTTAATAAGCGCATTAGACTCAAAGTCTAGCAAAAA。

5.如权利要求3所述的抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体的制备方法，其特征在于，选用了人的U6启动子作为shRNA表达的调控序列。

6.如权利要求3所述的抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体的制备方法，其特征在于，用链霉素抗性反筛的方法，将抑制caspase-1表达的小RNA基因序列敲入到杆状病毒载体的骨架上。

7.一种抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体，其是由权利要求3-6任意一项的方法制备得到。

8.权利要求1-2或7中任意一项所述的抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体在构建表达外源基因的重组杆状病毒中的应用。

9.权利要求1-2或7中任意一项所述的抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体在蛋白药物和疫苗生产中的应用。