[发明专利]一种抗细胞凋亡的重组杆状病毒载体及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于病毒载体技术领域，尤其涉及一种抗细胞凋亡的杆状病毒载体及其制备方法。

背景技术：

杆状病毒是特异感染节肢动物的DNA病毒，苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒（AcMNPV）是杆状病毒的一个模式种。自从1983年Smith等首次把杆状病毒改造成为表达系统以来，由于该系统具有低成本、高产量等优点，而且表达的蛋白构象接近天然真核蛋白，杆状病毒表达系统在科研和生产中被广泛应用。

杆状病毒表达系统是一种暂态表达系统，病毒感染昆虫细胞3-4天后会引起细胞的凋亡和死亡。基于晚期启动子的杆状病毒表达系统的表达时限是从感染后22-24小时开始至宿主细胞死亡。如果能推迟感染细胞的死亡时间，势必能增加外源蛋白的产量。研究表明，p10与寄主细胞的裂解有关。一些商品化的杆状病毒载体删除了p10基因，显著提高了感染细胞的存活率，从而提高了外源蛋白产量。另一种尝试是将多态DNA病毒的vankyrin基因插入到杆状病毒基因组DNA中，适量表达的vankyrin可以延长感染细胞的存活期，同样也达到了提高外源蛋白产量的目的。

细胞凋亡是细胞的一种程序性死亡过程，其中细胞调控caspase活性对细胞凋亡非常重要。而草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞中目前研究最多的caspase是执行caspase即Sf-caspase-1。2007年，台湾的一个课题组用RNA干扰载体在Sf9细胞中表达Sf-caspase-1的dsRNA，成功沉默了细胞中的Sf-caspase-1，从而筛选出抑制Sf9细胞凋亡的细胞系（Lin C C, Hsu J T A, Huang K L, et al. Sf‐Caspase‐1‐repressed stable cells: resistance to apoptosis and augmentation of recombinant protein production[J]. Biotechnology and applied biochemistry, 2007, 48(1): 11-19.）。

本发明基于这些研究背景，把干扰昆虫细胞caspase-1表达的小RNA的基因和调控序列敲入到杆状病毒载体骨架上，制作出了能延长感染细胞存活期的重组杆状病毒载体。

发明内容：

针对上述问题，本发明实施例的目的在于提供一种抗细胞凋亡的杆状病毒载体及其制备方法。

本发明实施例是这样实现的，一种抗细胞凋亡的杆状病毒载体的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

扩增并克隆U6启动子，构建表达载体pTriExU6；

设计shRNA1、shRNA2和shRNA3，合成引物；

用引物扩增的方法获得shRNA的基因片段；

将shRNA的基因片段克隆到表达载体，获得表达质粒；

用PCR方法扩增带U6-shRNA基因的反筛片段；

将反筛片段与AcMNPV Bacmid_KOchiA 共转化到含pRed/ET的大肠杆菌HS996菌株，筛选Bacmid_U6-shRNA；

测序验证重组病毒载体的正确性。

具体操作步骤，首先参照NCBI中Homo sapiens clone phU6A U6 small nuclear RNA, promoter region（序列号57232342）序列设计引物，PCR扩增获得U6启动子的DNA片段，双酶切后克隆到pTriEx的SacII和pstI两个位点之间的，获得表达载体pTriExU6。

根据Spodoptera frugiperda caspase-1 mRNA序列（序列号1814278），设计三段干扰caspase-1表达的小RNA基因序列为：

shRNA1（SEQ ID NO.1）: GCTAGGATGCCAGTTGATAGATTAATAAGCTCTATCAACTGGCATCCTAGCAAAAA

shRNA2（SEQ ID NO.2）: GCTGTATGCCAAAGATACTCATTAATAAGCTGAGTATCTTTGGCATACAGCAAAAA

shRNA3（SEQ ID NO.3）: GCTAGACTTTGAGTCTAATGCTTAATAAGCGCATTAGACTCAAAGTCTAGCAAAAA