[发明专利]一种免疫细胞治疗的双功能新型载体

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种用于免疫细胞治疗的新型双功能载体。

背景技术

基因编辑技术对目的基因进行精确操作，实现基因定点突变、插入、删除，以此直接启动、关闭某些基因，甚至直接在分子水平对致病基因进行编辑、修改，从而对未知功能基因进行研究和基因治疗的技术。最为常用的基因编辑技术是基于Cas9重组酶识别靶向的sgRNA序列确定指定基因位置，然后进行定向的基因编辑。目前可以通过直接编辑缺陷基因使其在体细胞内正常表达，改变遗传缺陷患者无法治愈、只能依赖终身服药的现状。目前，基因编辑技术已经在酪氨酸血症、β-地中海贫血病等疾病上取得一定进展，成功治愈了患有酪氨酸血症的成年小鼠，该技术在成年哺乳动物活体内证明了其治疗遗传缺陷病的疗效和安全性，是人类基因疗法的一个重大突破。

CAR-T 疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）是指利用基因工程方法将CAR 稳定表达在特异性T 细胞中，经过活化扩增，进入体内选择性识别并杀死病变肿瘤细胞的细胞治疗方法。CAR-T 疗法与其它传统细胞疗法相比优势明显，临床缓解率达到80%以上。CAR是基于抗原抗体识别作用，人工合成用于激活淋巴细胞的蛋白，尤其是T细胞。CAR包含一个与多种胞内信号分子融合的单链可变片段（scFv），其中scFv片段主要功能是识别高表达或者特异性表达于肿瘤细胞的抗原。

CAR技术的优势：1）CAR 克服了以往的肿瘤特异性TCR 靶向肿瘤的MHC 限制性，解决了肿瘤细胞下调MHC 表达导致免疫逃逸的问题；2）蛋白类抗原和糖脂类抗原都可作为靶抗原，扩展了肿瘤分子靶点范围；3）CAR 含有共刺激分子，促进了T 细胞的增殖和存活时间，能够抵抗肿瘤局部免疫抑制微环境；4）除了T 细胞，自然杀伤细胞( natural killer cell，NK 细胞) 和细胞因子诱导的杀伤细胞( cytokine induced killer cell，CIK 细胞)均可被CAR 修饰，发挥靶向治疗作用。

CAR-T 只通过增加CAR 元件胞内信号分子数目提高肿瘤细胞杀伤力，无法解决副作用及应用难点。目前的CAR-T 疗法的改造都是集中在CAR 元件的胞内信号区（CAR 元件组成），基本的思路都是通过不断增加CAR 元件胞内信号分子数目以提高T 细胞的细胞活性和细胞毒性，从而提高肿瘤细胞杀伤力。我们认为目前的这些改进都无法解决CAR-T 疗法固有的副作用（细胞因子释放综合征、脱靶毒性）以及应用难点（实体瘤治疗效果较差、无法现货供应），部分患者在进行CAR-T 治疗后出现较大的副作用进而导致死亡。因此，需要一种新型的免疫细胞载体来解决现有的载体缺陷。

发明内容

本发明目的为提供一种免疫细胞治疗的新型双功能的载体，该载体同时可以针对靶基因A的基因编辑，同时还可以实现针对蛋白B的靶向识别的特性。

在本发明的第一方面，新型载体中提供了基因编辑功能，该功能可以用于疾病管家基因的编辑：敲除、缺失、突变等。

在本发明的第二方面，新型载体中提供了CAR结构域，该结构可协助免疫细胞特异性的识别非正常状态的靶细胞（例如肿瘤细胞），从而实现将目标细胞杀死或者抑制的作用。

在本发明的第三方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次包括以下元件：

RNA聚合酶Ⅲ启动子、sgRNA序列，RNA聚合酶Ⅱ启动子、CAR结构、2A-Cas9结构。

在另一优选例中，所述的RNA聚合酶Ⅲ启动子包括：H1 启动子或者U6启动子。

在另一优选例中，RNA聚合酶Ⅱ启动子包括：CMV启动子，EF1a启动子，Ubiquitin启动子，或SV40启动子。

在本发明的第四方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第三方面中所述的表达盒。

在另一优选例中，所述的表达载体包括质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、或腺相关病毒载体。

在本发明的第五方面，提供了一种双功能新型载体，所述的功能包括(i)可敲除基因的载体以及(ii)表达嵌合型结构域的载体。

在本发明的第六方面，提供了一种本发明第四方面所述表达载体或本发明第二方面所述的新型载体的用途，它们被用于制备工程化免疫细胞，为免疫细胞治疗提供有效载体工具。