[发明专利]适合代谢组学水牛胚胎培养及检测胚胎发育潜能的方法

说明书

技术领域

本发明属于水牛胚胎培养及检测技术领域，尤其涉及一种适合代谢组学水牛胚胎培养及检测胚胎发育潜能的方法。

背景技术

代谢组学是研究细胞和生物体的所有代谢中间体和终产物的一门新兴科学，相对于DNA或蛋白质等生物高分子而言，代谢组学的研究对象一股为分子质量在1000Da以下的小分子。由于代谢网络处于基因调控、信号传导及蛋白质互作网络的下游，因此代谢组学研究反映了基因组、转录组和蛋白质组受内外环境影响下相互协调作用的最终结果，代谢组学的研究更接近于细胞或生物的表型。代谢组的功能和代谢组学的重要性使代谢组学成为生物学中继基因组学、转录组学、蛋白质组学后的又一个重要的组学平台，被广泛地应用于医学、药学、微生物学、环境学和食品科学等生命科学的各个研究领域。

代谢组学具有如下特点：首先，与细胞或机体的基因和蛋白质相比，代谢物数量显著少，人类基因组大约包含2.5万个基因，编码10万～20万个转录子，翻译100万种蛋白质，却仅产生2500～3000种代谢物，故代谢组检测要比转录组或蛋白组检测简单廉价。其次，转录组及蛋白组的改变并不总是与细胞表型相关，而代谢物组是基因表达的终产物，反应了细胞的真实功能状态，可较前者更准确地评估基因功能。最后，基因过度表达等微小变化经转录组和蛋白组逐级放大后，在代谢物水平上更易被检测。

胚胎质量的优劣直接关系到胚胎移植后妊娠效率。目前对胚胎质量的评估中，应用最为广泛的是对胚胎发育时期各阶段的形态特征进行评分。近年来在形态学结合实时成像分析系统对胚胎发育过程进行连续观察并对其进行选择，但却无具体的数值标准来判定，且容易受观察者主观影响。而通过检测胚胎培养基中代谢物的代谢组学方法可更有效地分析胚胎活性，有效地反映细胞发育情况，预测胚胎发育的最终结果，对提高胚胎附植率将有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种适合代谢组学水牛胚胎培养及检测胚胎发育潜能的方法，该法可为胚胎生产中的胚胎移植前胚胎质量提供判断依据。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：适合代谢组学的水牛胚胎培养方法，第一步，取未成熟的水牛卵母细胞，经体外成熟、体外受精后获得假定受精胚胎进行群体 培养；第二步，待胚胎发育到囊胚阶段，进行单胚胎培养。

上述适合代谢组学的水牛胚胎培养方法，按以下操作进行：取未成熟的水牛卵母细胞进行体外成熟，将体外成熟的卵子经体外受精后，把假定受精胚胎放到共培养液体系中，微滴群体培养；待胚胎发育到囊胚阶段，用捡卵针捡出囊胚，用PBS溶液洗涤1-2次，放入事先在培养箱中平衡2h以上的20μl盖油的SOF液(SOF液成分参照Carolant et al.，1995，Theriogenology 43：1115-l 128)培养，每个胚胎一滴，于培养箱中继续培养5-6h后，收集代谢液到200μl的EP管中-80℃冻存。

检测水牛胚胎发育潜能的方法，按上述培养方法进行培养，单胚胎培养后收集代谢液；通过LC/MS检测囊胚代谢液成分，通过PCA数据分析鉴定胚胎发育能力。

代谢液按以下操作进行预处理：首先把样品从-80℃冰箱中，放入冰面上解冻，然后用超纯水预洗涤一次膜的Merck Millipore离心过滤管，4度12000g.min^-1离心15min。

LC/MS检测条件及参数按以下设置：

选择前用乙晴冲洗柱子15min，用95％的0.1％甲酸水平衡柱子15min；

选择方法：液相，A相0.1％甲酸水，B相100％乙腈；其中，

0-2min 5％乙腈，

2-20min 5％乙腈-95％乙腈，

20min-23min 100％乙晴，

23min-23.1min 5％乙晴，

23.1min-25min 5％乙晴，

流速为0.30mL/min；进样量：2μL；

一级质谱参数：

二级质谱参数：

HEST SOURCE参数：