[发明专利]一种检测人类MET基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术及临床分子诊断技术领域，涉及一种检测人类MET基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒。

背景技术

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各癌症之首，肺癌病例中80％-85％为非小细胞肺癌(nonsmallcelllungcancer，NSCLC)。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。近年来中国肺癌的发病率和病死率均呈显著升高的趋势，在我国肺癌患者5年的生存率仅为13％，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相匹配科学的治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。

目前，手术、放疗和化疗一直是NSCLC的主要治疗方法，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果会有较大差异。近年来，随着对肿瘤发病机制及其生物学行为研究的不断深入，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床治疗领域成为研究热点。c-met是一种由c-met原癌基因编码的蛋白产物，为肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)的酪氨酸激酶受体，具有酪氨酸激酶活性，其胞内的近膜区部分由MET基因14号外显子编码，包含重要的调节元素。HGF-MET信号异常激活的主要方式包括：HGF过表达、MET扩增、MET蛋白过表达以及MET基因突变。目前认为，c-met与多种癌基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和运动的重要因素。2014年7月，美国癌症基因研究组(TheCancerGenomeAtlas，TCGA)在Nature杂志上发布了230例可切除肺腺癌的包含DNA，mRNA，miRNA水平的综合基因谱分析结果，通过对mRNA和DNA高通量测序结果及序列比对分析，发现4％(10/230)肺腺癌病例的MET基因DNA水平第14号外显子剪接区域的突变导致METEX14在mRNA水平出现部分或完全跳跃缺失(exon14-skipping)。在这项发现提出以后的短短1年半时间，科研人员就METexon14-skipping发表的的研究已超过10项，有研究发现MET基因14外显子跳跃缺失多发生于非小细胞肺癌，并以其中的肺肉瘤样癌和腺癌更多见，在肺腺癌中的发生率约3-4％，在肺肉瘤样癌中的发生率可高达22％。

MET14外显子剪接突变，与EGFR突变，K-ras突变的不共存现象以及含有该基因患者的鲜明临床特征，提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物。小分子酪氨酸激酶抑制剂克唑替尼(Crizotinib)对含有MET基因突变的肺癌患者疗效显著，引起人们的极大兴趣和研究热情。2016年非小细胞肺癌NCCN(2016V2)指南中，建议MET基因14外显子剪接突变患者可选克唑替尼。至此，MET抑制剂克唑替尼的适应症有：ALK重排、MET扩增、ROS-1重排、MET14外显子剪接突变。

目前，MET14外显子剪接突变检测尚没有商品化试剂盒，少数研究机构使用高通量测序的方法进行全外显子扫描，可以发现是否存在MET14外显子剪接突变，该方法灵敏度高，可以同时检测几十甚至几百个肿瘤相关基因，但是操作复杂，后期数据处理繁琐，检测周期长且检测的成本昂贵，对于操作和判读技术的要求很高，临床实际应用中仍存在许多不足，鉴于以上原因现阶段高通量测序尚无法适用于MET突变阳性NSCLC患者的大规模筛查和诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人类MET基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒。

本发明提供一种特异引物对甲，由引物1和引物2组成；

所述引物1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物2为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(a4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。

所述特异引物对甲的用途为如下(c1)或(c2)：

(c1)制备试剂盒；所述试剂盒的功能为检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基因14外显子跳跃缺失的突变；

(c2)检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基因14外显子跳跃缺失的突变。