[发明专利]一种滁菊叶片离体高效再生的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种滁菊叶片离体高效再生的方法。

背景技术

滁菊(Dendranthema morifolium CV.‘chuju’),为滁州市特有的传统产品，为重要的中草药及经济作物，有滁州贡菊之称。属药、茶兼用佳品，具有极高的药用和保健价值，在中国已有几百年的栽培历史。长期饮用滁菊具有清热解毒、舒筋活血、护肝明目、增强人体免疫力等功能，同时对冠心病、高血压疗效显著。滁菊名列安徽省“四大”著名道地药材之首和中国“四大”药菊之首。目前，滁菊已经成为滁州当地支柱产业，在滁州地区大面积种植。

但目前在生产上，由于滁菊长期采用扦插和分株等传统的无性繁殖手段进行繁殖，使得滁菊普遍存在品种退化、病虫害严重、相关品种改良和更新速度慢等问题，大大限制了以滁菊作为药、茶兼用佳品进行大规模栽培和产业化的应用。因此，加强其品种改良，培育高产、优质且抗虫滁菊优良品种是当前发展滁菊产业最为迫切的任务。目前有关滁菊育种的研究，主要集中在利用杂交手段进行，远不能适应菊农对品种产量和品质的要求。

由于利用组织培养技术可在短期内可获得大量的无菌苗，可在实现滁菊的优良种质资源规模化生产的同时，使得加速滁菊的品种改良进程成为可能。目前有关滁菊离体再生的研究较少，其中利用滁菊叶片为外植体进行离体再生的研究已有报道，但普遍存在繁殖系数低、可重复性差、外植体易变黑死亡和分化过程玻璃化现象严重等问题，严重限制了叶片在滁菊离体快繁中的应用。针对上述滁菊种植中所存在的诸多问题，同时为了满足规模化种植和品种改良对滁菊优质种苗的需求，急需开发一种滁菊叶片离体高效再生的方法。

发明内容

本发明的目的在于运用植物组织培养技术，提供一种滁菊叶片离体高效再生的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种滁菊叶片离体高效再生的方法，包括以下步骤：

1)取材：选取滁菊叶片作为外植体；

2)切片：将步骤1)中的滁菊叶片进行切片；

3)愈伤组织的诱导:将步骤2)中的切片接种于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导培养；

4)愈伤组织的增殖：将步骤3)中诱导的切片愈伤组织接种于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖；

5)愈伤组织的分化：将步骤4)中增殖后的愈伤组织切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化；

6)不定芽的增殖和伸长：将步骤5)中分化出不定芽的愈伤组织转接于不定芽增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养；

7)生根：待不定芽伸长至2～3cm,并伴有2～3个完全伸展的叶子时进行生根培养。

优选地，所述步骤1)的滁菊叶片为田间滁菊优良株系当年生幼嫩枝条的叶片或离体再生所获得的滁菊无菌苗完全伸展的叶片。

优选地，所述滁菊叶片离体高效再生的方法还包括表面消毒；表面消毒：将步骤2)中取材于田间的当年生幼嫩枝条的叶片经75％的无水乙醇擦拭一遍后，无菌工作台中用无菌水冲洗2～3遍；然后用75％的无水乙醇消毒10～25s后，用无菌水清洗2～3遍；然后用0.1％HgCl2溶液消毒1～3min,无菌水冲洗5～6遍。

优选地，所述步骤3)中愈伤组织诱导培养基包括MS+0.1～3.0mg/L TDZ+0.01～0.05mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂，pH＝5.8。

优选地，光照培养14～16d后，将步骤3)中诱导的叶片愈伤组织接种于增殖培养基中进行愈伤组织的增殖；其中愈伤组织增殖培养基为MS+0.2～2.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

优选地，光照培养10～14d后，将步骤4)中增殖后的愈伤组织切成(0.4～0.5)×(0.4～0.5))cm²大小的切块并转接于分化培养基中进行愈伤组织的分化；其中愈伤组织的分化培养基为MS+0.2～1.0mg/L TDZ+0.05～0.2mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。

优选地，光照培养21～28d后，将步骤5)中分化出不定芽的愈伤组织转接于不定芽增殖和伸长培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养；其中不定芽增殖和伸长培养基为MS+0.5～2.0mg/L 6-BA+0.05～0.2mg/L TDZ+0.2～2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,pH＝5.8。