[发明专利]一种制备固定化芳香化酶的方法

说明书

本发明提供了一种制备固定化芳香化酶的方法。该方法采用环氧基功能化修饰的介孔硅球在低温下吸附固定芳香化酶，固定化酶持续催化时失活半衰期有所提高，游离的芳香化酶在40min后催化反应速率有所降低，而固定化酶在80min后催化反应速率才有所降低。固定化率可达90％以上，并且固定化酶可以重复利用多次，解决了游离芳香化酶持续催化时易失活，参加反应后不可回收利用的弱点，使得该固定化酶在医药研究领域对于构建新型的芳香化酶抑制剂的快速筛选技术平台具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及制备固定化芳香化酶的方法，具体利用的技术为表面环氧基功能化修饰的介孔硅球吸附法。

背景技术

芳香化酶(aromatase)又名CYP19，是细胞色素P450酶系中的一种，是体内雌雄激素转化的关键酶。它在NADPH存在的条件下，能将雄烯二酮和睾酮分别转化为雌酮和雌二醇，多种对雌激素有依赖的肿瘤如乳腺癌、子宫内膜癌、恶性卵巢肿瘤都有芳香化酶的过度表达。其中芳香化酶与乳腺癌关系尤为密切，约60％～70％的乳腺癌的生长依赖于雌激素。芳香化酶抑制剂使芳香化酶失去作用，雄激素无法转化为雌激素，从而阻断了雌激素作用下肿瘤细胞的生长。由于芳香化酶只催化雌激素合成的最后一步反应，抑制芳香化酶并不会影响到体内其他激素的合成，因此芳香化酶是预防和治疗激素依赖型乳腺癌的一个重要靶点。近年来，芳香化酶抑制剂的问世使得乳腺癌治疗迈入了新的阶段，并逐渐成为治疗绝经后妇女乳腺癌的一线药物，如来曲唑，依西美坦等。

对芳香化酶抑制剂结构改造和从天然产物中筛选芳香化酶抑制剂的工作是新药开发的研究热点，但由于种种原因，目前已有的筛选模型已不能满足国内外新药开发产业对于高通量的芳香化酶的活性筛选方法的需求。目前筛选芳香化酶抑制剂的模型主要有两种：一种是细胞株培养法，另一种是以胎盘的微粒体作为芳香化酶的酶源，检测手段为放射性标记法或者利用试剂盒检测反应中产生的雌酮浓度，以此测定芳香化酶抑制剂的活性。专利CN 103149186 B发明了一种利用均相时间分辨荧光技术实现对芳香化酶抑制活性进行高通量筛选。以胎盘的微粒体中存在的游离芳香化酶为筛选模型存在以下明显缺陷：(1)酶源来之不易，每次筛选试验均需要寻找新鲜人体胎盘来制备微粒体作为芳香化酶的酶源，原材料获取存在医学伦理问题；(2)经人体胎盘提取的微粒体是多种激素转化酶的混合物，多种酶会相互竞争催化底物转化为不同产物，而且每次提取得到的混合物种芳香化酶活力均有差异，无法有效评价待筛选药物；(5)反应后的酶与产物分离困难，无法回收再利用。

上述游离芳香化酶的缺点成为了芳香化酶抑制剂筛选的瓶颈，而固定化酶技术与游离酶相比，具有许多优点：(1)极易与底物、产物分离；(2)可以在较长时间内进行反复使用，成本降低；(3)能够提高酶的稳定性等。酶的固定化方法有吸附法、共价键合法、交联法和包埋法。但是由于酶的个体差异，并没有一种普适的固定化技术适用于所有的酶，截止到目前还没有一种芳香化酶的固定化技术公布于世，而芳香化酶作为一个非常重要的乳腺癌治疗靶点，将其固定化后可以构建新型的芳香化酶抑制剂的快速筛选技术平台，为新药开发提供有力的工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种非常简便有效的方法固定化芳香化酶。本发明的方法是通过环氧基功能化修饰的介孔硅球利用吸附法固定芳香化酶。

本发明的固定化芳香化酶的制备方法，包括以下步骤：

(a)球形介孔硅球用稀盐酸活化即得固体介质A，其中盐酸浓度为5％～10％。

(b)制备环氧基修饰的介孔硅球为固体介质B。

(c)芳香化酶用磷酸钾缓冲液稀释为液体介质C，其中酶浓度为10pmol/mL～40pmol/mL。

(d)将固体介质B用磷酸钾缓冲液洗涤三次后，与液体介质C混合，低温下旋转震摇30min以上，离心除去上清液，沉淀经低温离心洗涤后即得固定化酶。