[发明专利]一种产5-酮基-22;23-双氢多拉菌素的基因工程菌及其制备方法和应用有效
| 申请号： | 201610269558.9 | 申请日： | 2016-04-27 |
| 公开（公告）号： | CN105754921B | 公开（公告）日： | 2019-07-02 |
| 发明（设计）人： | 向文胜;张继;王相晶;刘重喜 | 申请（专利权）人： | 东北农业大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12P19/62;C12R1/465 |
| 代理公司： | 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 | 代理人： | 梁超 |
| 地址： | 150030 黑龙*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 酮基 22 23 多拉 菌素 基因工程 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌的制备方法，其特征在于：以产多拉菌素的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069为出发菌株，将阿维菌素聚酮合酶中AveDH2-KR2结构域的编码基因aveDH2-KR2替换为Streptomyces bingchengsis米尔贝霉素聚酮合酶中MilDH2-ER2-KR2结构域的编码基因milDH2-ER2-KR2，然后再将AveF的编码基因aveF中断后得到的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a)构建milDH2-ER2-KR2基因替换质粒，其含有aveDH2-KR2基因同源重组左臂、milDH2-ER2-KR2基因和aveDH2-KR2基因同源重组右臂；
b)将步骤a)所得的milDH2-ER2-KR2基因替换质粒转化宿主细胞，获得转化子；
c)将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069作为受体，与步骤b)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil；
d)构建aveF基因中断质粒，其含有aveF基因同源重组左臂和aveF基因同源重组右臂；
e)将步骤d)所得的aveF基因中断质粒转化宿主细胞，获得转化子；
f)将步骤c)得到的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil作为受体，与步骤e)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换和aveF基因被中断的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的aveDH2-KR2基因同源重组左臂片段的构建引物a1核苷酸序列如SEQ ID NO.1，引物a2核苷酸序列如SEQ IDNO.2。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的milDH2-ER2-KR2基因的引物b1核苷酸序列如SEQ ID NO.3，引物b2核苷酸序列如SEQ ID NO.4。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的aveDH2-KR2基因同源重组右臂片段的构建引物c1核苷酸序列如SEQ ID NO.5，引物c2核苷酸序列如SEQ IDNO.6。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d)中aveF基因同源重组左臂片段的构建引物aveF-F1核苷酸序列如SEQ ID NO.7，引物aveF-R1核苷酸序列如SEQ IDNO.8；aveF基因同源重组右臂片段的构建引物aveF-F2核苷酸序列如SEQ ID NO.9，引物aveF-R2核苷酸序列如SEQ ID NO.10。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤b)和步骤e)中所述宿主细胞为大肠杆菌ET12567。
8.一种权利要求1-7任一所述方法制备的产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌。
9.一种权利要求1-7任一所述的制备方法制备的基因工程菌在发酵生产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
a)构建milDH2-ER2-KR2基因替换质粒，其含有aveDH2-KR2基因同源重组左臂、milDH2-ER2-KR2和aveDH2-KR2基因同源重组右臂；
b)将步骤a)所得的milDH2-ER2-KR2基因替换质粒转化宿主细胞，获得转化子；
c)将阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069作为受体，与步骤b)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil；
d)构建aveF基因中断质粒，其含有aveF基因同源重组左臂和aveF基因同源重组右臂；
e)将步骤d)所得的aveF基因中断质粒转化宿主细胞，获得转化子；
f)将步骤c)得到的Streptomyces avermitilis Mil作为受体，与步骤e)所述的转化子进行接合转移，挑取同源重组双交换子，即aveDH2-KR2被milDH2-ER2-KR2所替换和aveF基因被中断的基因工程菌Streptomyces avermitilis Mil-AveF；
g)以Streptomyces avermitilis Mil-AveF发酵生产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素。
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