[发明专利]一种产5-酮基-22;23-双氢多拉菌素的基因工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种产5‑酮基‑22,23‑双氢多拉菌素的基因工程菌及其制备方法和应用，该基因工程菌是是以产多拉菌素的阿维链霉菌Streptomyces avermitilis NEAU1069为出发菌株，将阿维菌素聚酮合酶中AveDH2‑KR2结构域的编码基因aveDH2‑KR2替换为Streptomyces bingchengsis米尔贝霉素聚酮合酶中MilDH2‑ER2‑KR2结构域的编码基因milDH2‑ER2‑KR2，然后再将AveF的编码基因aveF中断后而得到的基因工程菌。本发明的基因工程菌可直接用于5‑酮基‑22,23‑双氢多拉菌素的发酵生产。

技术领域

本发明涉及一种产5-酮基-22,23-双氢多拉菌素的基因工程菌及其制备方法和应用

背景技术

阿维菌素(avermectin)是由阿维链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生的十六元环大环内酯类聚酮化合物，具有良好的杀螨和杀线虫活性。以阿维菌素为母体化合物进行结构改造，已形成了包括伊维菌素(Ivermectin)、多拉菌素(Doramectin)、塞拉菌素(Selamectin)和埃谱利诺菌素(Eprinomectin)等一系列的阿维菌素类药物，在杀虫活性和药物动力学特性方面有了进一步的提高和改善。阿维菌素类药物能有效地防治农业害虫及多种害螨，特别是对常用农药产生抗药性的害虫和害螨具有良好的防治效果，对作物相对安全，不伤害天敌，已被广泛用于农业害虫和害螨的防治。此外，阿维菌素类药物对人和动物的寄生线虫和节肢动物类寄生虫具有很好的驱杀活性，且具有广谱、高效和低毒等优点，已用于兽医临床和人类寄生虫的防治，是目前销售量最大的抗寄生虫药物。最近的研究显示，阿维菌素类药物对包括多重耐药性和广泛耐药性的结核分枝杆菌具有良好的抑制活性，同时对溃疡分枝杆菌也展现出较好的生物活性；此外，阿维菌素还可以和甲氧西林互动抗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌，以上研究表明阿维菌素类药物在临床感染性疾病的防治方面应用潜力巨大。

2003年，科学家已完成了阿维菌素早期工业菌株Streptomyces avermitilis MA-4680的全基因组测序，阿维菌素生物合成基因簇及其合成和调控机制已逐步得到阐明。阿维菌素的生物合成分为三个阶段：(1)聚酮链的延伸。在阿维菌素聚酮合酶的作用下，以2-甲基丁酰辅酶A或异丁酰辅酶A为起始单元，然后由4个多功能模块聚酮合酶(AVES1、AVES2、AVES3和AVES4)添加5个甲基丙二酰辅酶A和7个丙二酰辅酶A形成聚酮链。不同的起始单元分别形成阿维菌素的“a”组分和“b”组分。(2)糖苷配基的形成。形成的聚酮链在AVES4中的TE结构域催化下形成环状，然后由AveC催化C22-C23之间的脱水和C17-C25螺缩醛酮的形成，脱水作用使C22-C23之间形成双键。根据C22-C23之间单键或双键将阿维菌素分为“1”组分和“2”组分，因此AveC是决定“1”组分和“2”组分比例的一个关键酶。AveC催化后分别由AveE催化C6和C8a间呋喃环的形成和由AveF催化C5酮基的还原，最后由AveD催化C5的O-甲基化，从而形成具有“A”和“B”组分的糖苷配基。(3)糖苷配基的糖基化 修饰。2个葡萄糖-1-磷酸由AveBII-VIII催化形成脱氧胸苷二磷酸-齐墩果糖，然后再由aveBI编码的糖基转移酶将脱氧胸苷二磷酸-齐墩果糖连接到阿维菌素糖苷配基的C13和C4′上形成阿维菌素。在对阿维菌素生物合成途径了解的基础上，通过对阿维菌素生物合成基因簇的改造已产生了一系列阿维菌素类结构类似物。对aveD基因的插入失活，阻断了C5-O-甲基转移酶的合成，并影响了与aveD共转录的aveF的表达，从而获得了合成C5-酮基阿维菌素的基因工程菌，所产生的C5-酮基阿维菌素可直接用于C5位结构修饰产生新的阿维菌素类化合物。将阿维菌素聚酮合酶模块2中的DH2-KR2用pikromycin聚酮合酶中模块4、寡霉素聚酮合酶中模块3或米尔贝霉素聚酮合酶中模块2的DH-ER-KR代替后，所构建的基因工程菌可产生C22-C23位是饱和单键的阿维菌素二代药物—伊维菌素。