[发明专利]无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法

权利要求书

1.一种无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21高密度发酵及IPTG诱导表达，收集菌体，采用高压均质机进行菌体细胞破碎，得破菌液；

b. 过滤破菌液得澄清液；

c．将澄清液通过镍离子亲和层析进行目的蛋白的捕获；

d. 利用Superdex 75分子筛进行蛋白的第二步精细纯化；

e. 利用Q FF阴离子交换进行蛋白的第三步纯化。

2.根据权利要求1所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述a步骤是将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21在LB培养基中高密度培养，OD₆₀₀达90，终浓度1 mM IPTG诱导表达后，30 ℃过夜培养，收获菌体并采用高压均质机进行菌体细胞破碎。

3.根据权利要求2所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述b步骤是先以体积比为1：1向破菌液中加入缓冲液稀释，再将稀释的破菌液用缓冲液稀释5倍，采用750K中空纤维微滤膜进行切向流过滤，得澄清液。

4.根据权利要求3所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述步骤c是采用镍离子亲和层析Ni 6 Fast Flow柱，所用的1×Binding buffer成分由5 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Washing buffe成分由 60 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Eluting buffe成分由 1 M imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9。

5.根据权利要求4所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述d步骤所用的PH 7.4的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液15.48 ml与1 M NaH₂PO₄贮液4.52 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。

6.根据权利要求5所述的无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于：所述e步骤所用的pH8.0的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄ 贮液18.64 ml与1 M NaH₂PO₄贮液1.36 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。