[发明专利]无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种rLj-RGD3蛋白的制备方法，尤其是一种高纯度无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法。

背景技术

Lj-RGD3为来源于日本七鳃鳗口腔腺分泌物的RGD毒素蛋白，由117个氨基酸残基组成，Lj-RGD3的一级结构除具有三个RGD 模体和一对半胱氨酸这一典型的RGD毒素蛋白特征外，还含有17个组氨酸，17个精氨酸，是一类HRG的碱性蛋白，已公开于专利号为200510083437.7、名称为“具抗肿瘤作用的日本七鳃鳗口腔腺RGD模体蛋白的基因克隆与表达”的中国发明专利文献中，即命名为Lampetrin3的蛋白，具有抗血管新生、抗肿瘤增殖、抗血栓等功效。rLj-RGD3是Lj-RGD3的基因重组蛋白，该重组蛋白没有任何纯化标签。

内毒素是存在于革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，也叫做脂多糖，对宿主具有毒性。内毒素的主要毒性成分为类脂质A，其位于细胞壁的最外层，覆盖于细胞壁的黏肽上，当细菌死亡溶解或者用人工方法破坏细菌细胞后，内毒素会从细菌中释放出来。内毒素可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等症状，因此对生物制品的内毒素含量有严格的限定，在生物制品的制备过程中内毒素的去除是必不可少的一个环节。由于rLj-RGD3来自于大肠杆菌的表达上清，因此所收集的菌体破碎液中会含有大量内毒素，而内毒素不是蛋白质，因此非常耐热，只有在160℃的温度下加热2~4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性，但是在破坏内毒素活性的同时，也破坏了rLj-RGD3的活性。

目前，对于rLj-RGD3的制备过程中大多需要采用高压均质机进行菌体细胞破碎，之后再采用离心方法进行菌体收获及澄清，存在明显弊端：由于菌液粘度大，限制的离心机的离心速度，需要多台离心机连续工作，不仅导致极高的设备投资和日常维护成本，而且操作繁琐、劳动强度大、参数不可控、易受人为因素干扰，不利于大规模的生产和工艺放大，影响生产工艺的重复性。虽然，后续也有对澄清液进行纯化的步骤，但是并不能将所含有的内毒素彻底去除。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种高纯度无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种无内毒素的rLj-RGD3蛋白制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21高密度发酵及IPTG诱导表达，收集菌体，采用高压均质机进行菌体细胞破碎，得破菌液；

b. 过滤破菌液得澄清液；

c．将澄清液通过镍离子亲和层析进行目的蛋白的捕获；

d. 利用Superdex 75分子筛进行蛋白的第二步精细纯化；

e. 利用Q FF阴离子交换进行蛋白的第三步纯化。

所述a步骤是将转化有pET23b-RGD3重组质粒的大肠杆菌BL21在LB培养基中高密度培养，OD₆₀₀达90，终浓度1 mM IPTG诱导表达后，30 ℃过夜培养，收获菌体并采用高压均质机进行菌体细胞破碎。

所述b步骤是先以体积比为1：1向破菌液中加入缓冲液稀释，再将稀释的破菌液用缓冲液稀释5倍，采用750K中空纤维微滤膜进行切向流过滤，得澄清液。

所述步骤c是采用镍离子亲和层析Ni 6 Fast Flow柱，所用的1×Binding buffer成分由5 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Washing buffe成分由 60 mM imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9；所用的1×Eluting buffe成分由 1 M imidazole，0.5 M NaCl，20 mM Tris-HCl组成，PH 7.9。

所述d步骤所用的PH 7.4的20 mM PBS缓冲液是由1M Na₂HPO₄贮液15.48 ml与1 M NaH₂PO₄贮液4.52 ml混合后，用H₂O定容至1000 ml配制而成。