[发明专利]一种25羟基维生素D3人工抗原、制备方法及应用

权利要求书

1.一种25羟基维生素D3人工抗原，其特征是结构式如下：

，是25羟基维生素D3的C19位置原子通过链接臂与载体链接。

2.根据权利要求1所述的一种25羟基维生素D3人工抗原，其特征是所述链接臂是长度1~20个原子的碳链；所述载体是天然蛋白质，牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、卵清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、谷胱甘肽S转移酶、纯化的重组蛋白、人工合成多肽、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔戚血蓝蛋白、多价抗原肽中的一种,或是人工蛋白、酶、多肽、聚合物中的一种。

3.根据权利要求2所述的一种25羟基维生素D3人工抗原，其特征是链接臂碳链上的原子被N，O，S，P之一原子，或者被多元环，杂环取代。

4.根据权利要求2所述的一种25羟基维生素D3人工抗原，其特征是每个载体上链接的25羟基维生素D3数目是1~50。

5.权利要求1所述25羟基维生素D3人工抗原的制备方法，其特征是：将25羟基维生素D3利用选择性臭氧化，把25羟基维生素D3的C10=C19双键打开变成共轭酮，然后通过重新构建双键手段，把含有特征链接功能下述基团之一：C端，N端，羧基，氨基，羟基，巯基，马来酰亚胺基团或生物素特征基团的链接臂接到中间体得到半抗原，最后通过半抗原的链接端与载体偶联反应，得到25羟基维生素D3人工抗原，反应式如下：

R 是羧基，氨基，羟基，巯基，马来酰亚胺基团或生物素特征基团中的一种。

6.根据权利要求5所述的25羟基维生素D3人工抗原的制备方法，其特征是：所述的半抗原的制备步骤是：将把25羟基维生素D3溶解在乙醇中，在-78℃，通入臭氧反应5小时。反应结束后，蒸掉溶剂，用硅胶柱层析方法，以乙酸乙酯正己烷洗脱，收集组分，旋干得到中间体2，中间体2溶解在二甲苯或甲苯中，加热100-150℃，加入原料3，5，7，9，或11中的一种，反应5-8小时，蒸掉溶剂，直接进行硅胶柱层析，或用碱溶液或酸溶液洗涤，再用酸溶液或碱溶液调至中性，乙酸乙酯萃取浓缩，再进行硅胶柱层析；所述硅胶柱层析以乙酸乙酯正己烷或氯仿甲醇洗脱，收集组分，旋干得到半抗原；半抗原的合成路线如下：

。

7.根据权利要求5所述的25羟基维生素D3人工抗原的制备方法，其特征是：半抗原制备抗原的制备步骤如下：

（1）将载体溶解在PBS缓冲液中得到载体混合液；

（2）将半抗原与去离子水、载体混合液震荡混匀，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐4℃摇床搅拌过夜；得到人工抗原混合液；

（3）用氯化钠，十二水磷酸氢二钠，二水磷酸二氢钠，以摩尔比例80:4:1，溶解在去离子水中，制备0.1摩尔钠离子浓度的PBS缓冲液，pH值 7.2~7.4；

（4）将人工抗原混合液与PBS缓冲液中透析，透析完毕后离心清液即得到抗原。

8. 25羟基维生素D3酶联免疫试剂盒，其特征是包括包被25-羟基维生素D3的单克隆抗体、25羟基维生素D3人工抗原经标记物标记后得到的竞争性抗原，所述标记物为辣根过氧化物酶，试剂盒还包括底物液A、底物液B、样本稀释液、终止液和浓缩洗涤液。

9. 25羟基维生素D3化学发光免疫试剂盒，其特征是包括包被25-羟基维生素D3的单克隆抗体、25羟基维生素D3人工抗原经标记物标记后得到的竞争性抗原，所述标记物为吖啶酯，试剂盒还包括底物液A、底物液B、样本稀释液、中值质控血清和高值质控血清和浓缩洗涤液。

10. 25羟基维生素D3时间分辨免疫试剂盒，其特征是包括包被25-羟基维生素D3的单克隆抗体、25羟基维生素D3人工抗原经标记物标记后得到的竞争性抗原，所述标记物为双功能螯合剂；试剂盒还包括中值质控血清和高值质控血清、实验缓冲液、增强液和浓缩洗涤液。