[发明专利]一种25羟基维生素D3人工抗原、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗原、制备方法及应用，具体是一种25羟基维生素D3人工抗原、制备方法及应用。

背景技术

血清25羟维生素D3是合成1,25(OH)2VD3的前体,是维生素D的主要循环形式，其半寿期较长,血中浓度较稳定,可直接反映机体维生素D的水平。维生素D参与不但钙磷代谢的调节作用，近年来维生素D被证实具有更为广泛的生物学效应和免疫学效应，包括用以预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症，抑制多种类型细胞的增殖，诱导细胞调亡和分化，调节机体免疫系统的功能等。因此，血清中的25羟维生素D3已经成为健康体检的重要指标。

现在有越来越多公司参与开发25羟维生素D3检测试剂盒。高品质的抗原，是开发25羟维生素D3检测试剂盒的关键技术和基础。

由于维生素D化学合成技术非常复杂，多数公司因为缺乏维生素D化学技术，在开发25羟维生素D3抗原策略中，绝大多数都是采取修饰3位羟基，或者25位羟基。在羟基接入链接臂，虽然比较简单好实现，但是25羟维生素D3的羟基被偶联后使得关键基团被覆盖。这种策略下得到的抗原，以及用这种抗原免疫得到的抗体，不能足够精准识别25羟维生素D3。这也是造成当前的25羟维生素D3检测试剂盒，无论使用哪种技术，放射免疫法，胶体金，酶联免疫法，化学发光，磁微粒，都不能得到与HPLC精确测试相媲美的结果。即使偶尔接近，但是因为检测结果批间差较大，使得人们对检测到的血清中的25羟维生素D3浓度，不能足够信服。

也就是说，如果选用了具有结构设计缺陷的抗原，即使使用非常先进的检测技术，仍旧不能从根本上解决检测结果精准的系统性问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种25羟基维生素D3人工抗原、制备方法及应用，主要解决现有25羟基维生素D3人工抗原设计结构有缺陷导致无法精确检测的技术问题。

本发明的技术方案为：一种25羟基维生素D3人工抗原，结构式如下：

，是25羟基维生素D3的C19位置原子通过链接臂与载体链接。载体可以是天然蛋白质，牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、兔血清白蛋白、卵清白蛋白（OVA）、匙孔血蓝蛋白（KLH）、GST（谷胱甘肽S转移酶）、纯化的重组蛋白、人工合成多肽、BSA（牛血清白蛋白）、RSA(兔血清白蛋白)、HSA（人血清白蛋白）、OVA（卵清蛋白）、KLH（Knoweyhole Limpet Hemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白）、MAP（多价抗原肽，主要指多聚Lys）中的一种,也可以是人工蛋白，酶，多肽，聚合物等。

链接臂可以是长度1~20个原子的碳链，其中碳链的某些原子可以被N，O，S，P等原子，或者多元环，杂环取代。每个载体上链接的25羟基维生素D3数目是1~50。

本发明合成抗原的制备方法是：将25羟基维生素D3利用选择性臭氧化，把25羟基维生素D3（1）的C10=C19双键打开变成共轭酮，然后通过重新构建双键手段，把含有特征链接功能（C端，N端，羧基，氨基，羟基，巯基，马来酰亚胺基团或生物素特征基团中的一种）的链接臂接到中间体得到半抗原，最后通过半抗原的链接端与载体偶联反应，得到25羟基维生素D3人工抗原。反应式如下：

R 可以是羧基，氨基，羟基，巯基，马来酰亚胺基团或生物素特征基团中的一种。

所述的半抗原的制备步骤是：将把25羟基维生素D3溶解在乙醇中，在-78℃，通入臭氧反应5小时。反应结束后，蒸掉溶剂，用硅胶柱层析方法，以乙酸乙酯正己烷洗脱，收集组分，旋干得到中间体2，中间体2溶解在二甲苯或甲苯中，加热100-150℃，加入原料3，5，7，9，或11中的一种，反应5-8小时，蒸掉溶剂，直接进行硅胶柱层析，或用碱溶液或酸溶液洗涤，再用酸溶液或碱溶液调至中性，乙酸乙酯萃取浓缩，再进行硅胶柱层析；所述硅胶柱层析以乙酸乙酯正己烷或氯仿甲醇洗脱，收集组分，旋干得到半抗原。

半抗原的合成路线如下：

本发明半抗原制备抗原的制备方法如下：

（1）将载体溶解在PBS缓冲液中得到载体混合液；

（2）将半抗原与去离子水、载体混合液震荡混匀，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐4℃摇床搅拌过夜；得到人工抗原混合液；

（3）用氯化钠，十二水磷酸氢二钠，二水磷酸二氢钠，以摩尔比例80:4:1，溶解在去离子水中，制备0.1摩尔钠离子浓度的PBS缓冲液，pH值 7.2~7.4；