[发明专利]一种细胞系及其应用

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种单克隆细胞系、一种犬瘟热病毒毒株及其制备的疫苗组合物、制备方法及应用。

背景技术

犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)属副黏病毒科麻疹病毒属，为单股RNA，病毒粒子呈圆形或不整形。近年来，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，CDV的自然感染宿主已由传统的犬科(包括犬、狐狸、貉子等)、浣熊科和鼬科(水貂等)动物扩展到食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且呈现不断扩大的趋势。

犬瘟热病是由CDV引起的，是一种急性、高度接触性传染病，以发热呈双相热型、结膜炎、上呼吸道与肺及胃肠道卡他性炎症、皮炎、神经炎和足垫硬化为特征，极易继发其他细菌、病毒等混合感染和二次感染。染病犬的死亡率高达30％-80％，严重影响犬及其它易感染动物的健康，造成大批犬死亡，并可引起患病动物的严重后遗症，对宠物犬、养犬业和毛皮经济动物养殖业造成了严重的经济损失。

目前，CDV野毒株的分离方法包括：将早期感染犬瘟热动物的病毒阳性组织的研磨液的上清，与SPF犬的淋巴细胞、SPF雪貂的腹腔巨噬细胞或有丝分裂原刺激的犬淋巴细胞、犬肺泡巨噬细胞共培养以分离CDV野毒株，但这些淋巴细胞或巨噬细胞继代培养次数少且获取比较困难，另外有的要求SPF动物，不仅来源有限而且增加了实验成本和操作要求；也有极少采用接种鸡胚绒毛尿囊膜(Embryonated chicken eggs,ECE)、MV1Lu、Vero和MDCK细胞系分离培养CDV野毒株，但该方法多用于疫苗株的分离和传代，并且存在CDV野毒株分离率低及在MV1Lu、Vero、MDCK细胞上传代的CDV野毒株基因易发生突变的缺陷。

上世纪90年代，日本Kai教授利用表达绒猴SLAM的B95a细胞分离到Yanaka等多株CDV野毒株，但B95a细胞向外分泌EB病毒故存在生物安全隐患，并且分离率仅为43％；Seki F等人用两个真核表达载体构建了表达犬SLAM受体的Vero细胞系(Vero.DogSLAMtag)，并利用该细胞系分离CDV野毒株，分离率仅为71％(Kai C,Ochikubof,Tanaka K,et al.Use of B95a cells for isolation of canine distemper virus from clinical cases.J.Vet.Med.Sci.,1993,55:1067-1070；Seki F,Onon,Yamaguchi R,et al.Efficient isolation of wild strains of canine distemper virus in Vero cells expressing canine SLAM(CD150)and their adaptability to marmoset B95a cells.J.Virol.,2003,77(18):9943-9950)；刘玉秀构建的表达犬SLAM受体的敏感细胞系Vero/DogSLAM所表达的SLAM蛋白的表达量仅为46.5％，且该细胞系在CDV野毒株的分离与传代实验中最多使用到第5代次(刘玉秀.犬瘟热病毒敏感细胞系和感染性克隆的构建与初步应用研究.吉林大学博士学位论文,2014)。由此可见，从患病动物中快速、准确、高效地分离CDV野毒株存在一定困难，严重制约着我国对不同动物源犬瘟热病的深入研究。

另一方面，目前国内外预防和控制犬瘟热所用疫苗中涉及到的CDV毒株基因型均为上世纪30-40年代北美流行的北美I型、经过弱化的传统CDV疫苗株，如Onderstepoort株、Snyder Hill株、Lederle株、Convac株，而现阶段国内主要流行的是亚洲I型CDV野毒株。这些传统的CDV疫苗株与国内近10年流行的CDV野毒株在基因型上具有较大差距，存在抗原针对性不强的缺陷，从而导致国内犬瘟热疫情一直无法得到有效控制。因此，亟需分离出国内流行的CDV野毒株，将其制备成疫苗用毒株以预防和/或治疗犬瘟热疫情蔓延，具有较强的现实意义。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种单克隆细胞系，其能高效地从感染犬瘟热病毒的动物组织、组织样品或其培养物中分离犬瘟热病毒毒株，该单克隆细胞系对多种种属来源的犬瘟热病毒均能有效分离，分离率可达75％以上。