[发明专利]海洋芽孢杆菌N6-2及其产生的新型抗肿瘤活性蛋白

说明书

技术领域

本发明属于海洋微生物医药技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆菌N6-2及 其产生的一种新型抗肿瘤活性蛋白。

背景技术

由于南极地区独特的环境，使极地海洋微生物具备了独特的生理生化特性 以适应其自身的生存需求，极地微生物体内的次级代谢产物已经成为新天然药 物的重要来源地。目前对微生物的研究已经不仅仅局限于其基础研究，抗冻、 抗辐射、抗肿瘤等菌株也被不断发现，且其产生的活性物质将极可能成为新的 药用活性物质，有良好的研究及开发前景。美国专利检索产生抗肿瘤活性物质 的海洋微生物已授权相关专利5项，2004年Fenical等发现了一种新型的海洋放 线菌CNQ140，从中获得了环多烯类的天然产物，具有显著的抗肿瘤活性(Patent No.US7521414B2)。国内检索产生抗肿瘤活性物质的海洋微生物已授权相关专 利2项，2007年东南大学的杨瑞丽等发现了一种产生抗肿瘤活性物质的海洋链 霉菌,该菌的发酵液对多种肿瘤细胞均具有显著的细胞毒作用，并且能诱导肿瘤 细胞凋亡，是一株具有预防和治疗肿瘤潜力的菌株资源(授权公告号： 100554404))；2003年中国科学院海洋所的秦松等将海洋链霉菌Streptomycessp. 经发酵积累粗提物，利用硅胶层析等多种层析方法分离得到两种化合物，命名 为chinikomycinA和B，其对多种人体肿瘤细胞有抑制作用(授权公告号： 1296347)。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种海洋芽孢杆菌N6-2及其具有抗肿瘤作 用的活性蛋白和制备方法。

一种海洋芽孢杆菌N6-2(Bacillussp.N6-2)，该菌分离自南极海水，但不 局限于该来源地，该菌株能够产生具有抗肿瘤作用的活性蛋白，该海洋芽孢杆 菌N6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心，保藏号为 CCTCCNO:M2014586。

进一步，所述的海洋芽孢杆菌N6-2菌株为革兰氏阴性菌，且具有芽孢，菌 体形态呈现短杆棒状，多是有两个菌体相连，单个菌体的大小为：宽：0.9-1.5μm， 长：1-3.7μm。

进一步，所述的海洋芽孢杆菌N6-2的16SrDNA序列见序列表SEQ1。

本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白，该活性蛋白的分子量为 24kDa，所述活性蛋白N端15个氨基酸序列为STGGSFYEPFNNYNT。

进一步，所述海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的制备方法：海洋芽孢杆菌N6-2 菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃的摇床中100-300rpm，培 养25-30h；将上述培养后的菌株按3-7％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基 的摇瓶中，16-37℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除 掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法 粗提活性物质，获得10～30kDa组分，用硫酸铵沉淀法浓缩活性组分，浓缩的 海洋芽孢杆菌N6-2活性组分，过Q离子交换层析柱，将活性最好的穿透峰Q1 脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集活性 最好的穿透峰C1，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋 白。

进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8％，蛋白胨1-2％， 氯化钠0.3-1％，pH6.8-7.5。

进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度：蔗糖0.5-1％，牛肉膏0.2-0.8％， 蛋白胨1-2％，氯化钠0.3-1％，矿物油0.5-1‰，pH6.8-7.5。

本发明还提供一种海洋芽孢杆菌N6-2活性蛋白的制备方法，其步骤为：

(1)菌株的发酵：

取海洋芽孢杆菌N6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在16-37℃ 的摇床中100-300rpm，培养25-30h；

将上述培养后的菌株按4％(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中， 16-37℃，100-300rpm，发酵培养48-90h；取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中 的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。

(2)超滤法粗提活性物质