[发明专利]一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法在审
| 申请号： | 201610280456.7 | 申请日： | 2016-04-28 |
| 公开（公告）号： | CN105753974A | 公开（公告）日： | 2016-07-13 |
| 发明（设计）人： | 王旭;郑少亮;许文勤;肖益热 | 申请（专利权）人： | 广东天普生化医药股份有限公司 |
| 主分类号： | C07K14/81 | 分类号： | C07K14/81;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/20;C07K1/16 |
| 代理公司： | 北京精金石专利代理事务所(普通合伙) 11470 | 代理人： | 刘晔 |
| 地址： | 510520 广东省广州*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 亲和 层析 纯化 方法 | ||
1.一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取适量的pH值小于6.5的澄清尿液，加入适量的壳聚糖，并用精密pH试纸测定，调节尿液pH值到5.0-6.0；吸附完全后用氨水洗脱1.0-2.0h，再经过3-4kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；
(2)疏水柱层析，对乌司他丁粗品预处理，使用平衡液A平衡，控制上样速度并用平衡缓冲液A复平衡，使用洗脱液B洗脱；
(3)亲和层析，使用平衡液A平衡，控制上样速度并用平衡缓冲液A复平衡，使用洗脱液C洗脱；
(4)凝胶过滤层析，使用平衡液D平衡，控制上样速度并使用洗脱液E洗脱；
(5)凝胶过滤层析洗脱液超滤至57.5mL；
(6)洗涤：将步骤(5)的超滤液离心，固体用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(7)冻干：将步骤(6)的沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得乌司他丁。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述的平衡液A为10mmol/LHAc-NaAc缓冲液，pH值为6.0，加固体氯化钠调节cd60ms/cm；洗脱液B为10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH值为8.5。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述的平衡液C为10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH值为8.0；所述的亲和层析的为HiTraprProteinAFF层析柱ProteinASepharoseCL-4B填料或HiTraprProteinAHF层析柱ProteinASepharose4FF填料。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)所述的平衡液D为10mmol/LHAc-NaAc，pH值为6.0；洗脱液E为：10mmol/LHAc-NaAc，pH值为6.0。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取1TpH小于6.5的澄清尿液，不断搅拌，缓慢加入10kg壳聚糖，并用精密pH试纸测定，使用乙酸调节尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脱1.5h，再经过3.5kg硫酸铵盐析，静置24小时，沉淀、离心后置于用无水硫酸镁吸水剂的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得乌司他丁粗品；
(2)疏水柱层析，用XK50/20层析柱，PhenylSepharose6FastFlow填料
预处理：称取乌司他丁粗品1kg，用10mmol/LHAc-NaAc溶解，搅拌30分钟，离心20分钟，留取离心液，用乙酸调pH至6.0，加固体氯化钠调节cd至60ms/cm；
平衡：使用平衡缓冲液，具体为10mmol/LHAc-NaAc缓冲液，pH6.0，加固体氯化钠调节cd60ms/cm；调节泵流速为20.0ml/min，平衡8倍柱体积；
上样：以100ml/min流速上样，上样结束后，用平衡缓冲液10mmol/LHAc-NaAc缓冲液，pH6.0，加固体氯化钠调节cd60ms/cm，复平衡5倍柱床体积；
洗脱：使用洗脱液10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.5，洗脱，调节泵流速为20.0ml/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(3)亲和层析，选用HiTraprProteinAFF层析柱，ProteinASepharoseCL-4B填料，具体步骤为：
平衡：用4.4L的平衡缓冲液10mmol/LHAc-NaAc缓冲液，pH6.0，加固体氯化钠调节cd60ms/cm，平衡亲和层析柱，将疏水柱层析洗脱液流经平衡过的层析柱，流速控制在100mL/min；
上样：以100ml/min流速上样疏水柱层析的目的溶液，上样结束后，用平衡缓冲液10mmol/LHAc-NaAc缓冲液，pH6.0，加固体氯化钠调节cd60ms/cm，复平衡5倍柱体积；
洗脱：使用洗脱液10mmol/LTris-HCl缓冲液，pH8.0，洗脱，调节泵流速为100ml/min，开始洗脱，收集洗脱液；
(4)凝胶过滤层析，选用HR16/70层析柱Sephacryls-100HR填料，具体步骤为：
平衡：用HAc-NaAc缓冲液10mmol/LHAc-NaAc，pH6.0，平衡8个柱体积，平衡时泵流速为3.0ml/min；
上样：将亲和层析纯化洗脱液加入适量碱性溶液，上清液上样，上样时泵流速为3.0ml/min，样品上样量为柱体积的2％；
洗脱：上样完毕后，用HAc-NaAc液洗脱10mmol/LHAc-NaAc，pH6.0，调节泵流速为3.0ml/min，收集洗脱液；
(5)洗脱液经超滤膜超滤至57.5mL；
(6)洗涤：将步骤(5)的超滤液离心，固体用无水乙醇脱水两次，离心，弃去上清液，留取沉淀物；
(7)冻干：将步骤(6)的沉淀物装入盘进冻干机，冻干即得乌司他丁。
6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)中所述的超滤膜包括分子量为5000-3万的超滤膜。
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