[发明专利]一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法。

背景技术

乌司他丁，又名人尿胰蛋白酶抑制剂(HumanUrinaryTrypsinInhibitor)，是从人体尿液中分离纯化的一种胰蛋白酶抑制剂，1909年，Beurer和Reich第一次报道了人体尿液中存在这种胰蛋白酶抑制剂。他由是由143个氨基酸组成的一种糖蛋白，N端为丙氨酸，C端为亮氨酸，在第10位丝氨酸和45位天冬氨酸上有糖链。丝氨酸上的O-糖苷链包含多个硫酸软骨素单元(5个Ch4S和10个Ch0S)。乌司他丁的分子量经HPLC法测定为60～70KD，经SDS-PAGE测定为40～50KD，等电点为2.6，是一种对热稳定的酸性蛋白。

乌司他丁对多种水解酶具有有效的抑制作用，对细胞膜、溶酶体膜有明显的稳定作用。乌司他丁在人体内不仅仅是一种酶抑制剂，同时还是参与细胞表达分泌调控的重要生理活性物质，在炎症等疾病状态下，乌司他丁由粒细胞酶水解释放到血液中，参与炎症反应的调控，局限炎症反应，帮助组织的修复；在机体遭遇重大打击，发生全身炎症反应时，减轻过度释放的炎症介质对机体组织造成的损伤。乌司他丁在临床上用于急性胰腺炎、急性循环障碍的治疗，以及大中型手术期的器官保护和危重症中全身性炎症反应、多器官功能障碍综合症的预防等。

关于乌司他丁的纯化技术，国内有过报道比如：

中国专利CN103073638B公开了一种一种亲和层析纯化乌司他丁的方法，其中公开了一种亲和层析纯化乌司他丁的方法。具体的说，就是以健康成年男性新鲜尿液为原料，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg。经过亲和层析后含有部分镍离子。

中国专利CN100528898公开了一种高纯度乌司他丁及其制备方法和含有乌司他丁的药物组合物，其中的尿液经处理之后再经疏水柱吸附和亲和层析柱纯化，以及利用金属螯合柱和金属蛋白结合，通过磷酸盐缓冲液进行洗脱，使乌司他丁得以纯化，虽然得到一定纯度的乌司他丁但是需要的技术含量较高。

中国专利CN105384812公开了一种一种树脂再生提高柱效纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁复溶性的药物组合物，其中涉及纯化乌司他丁的方法，具体为经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg，柱效提升约50％。需要的技术含量较高。

中国专利CN105399819公开了一种一种亲和层析纯化乌司他丁的方法及提高乌司他丁稳定性的药物组合物，经过甲壳质吸附、氨水洗脱、硫酸铵盐析、吸附柱层析以及亲和层析等现代蛋白质高端生化分离技术来制备高纯度的乌司他丁，可以将总收率提高到70％以上，总效价不低于5000iu/mg。收率相对较低。

目前的乌司他纯化方法不能满足现有的要求，因此去除这些杂质进一步提高乌司他丁临床应用的安全性是十分必要的。

发明内容：

鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种亲和层析纯化乌司他丁的方法，方法中以亲和层析为基础，加入疏水柱层析和凝胶过滤层析来纯化乌司他丁粗品。最终得到的乌司他丁收率、比活优于现有技术，冻干乌司他丁成品的各项生化指标均优于中国药典规定。

为解决上述技术问题，具体而言，本发明过程是这样的。

一种基于亲和层析柱的乌司他丁纯化方法，选用亲和层析来纯化乌司他丁，所述的亲和层析优选为HiTraprProteinAFF或HiTraprProteinAHF层析柱和ProteinASepharoseCL-4B或ProteinASepharose4FF填料，经过纯化试验发现乌司他丁的总收率提高到80％以上，总效价在6000iu/mg以上。尤其是HiTraprProteinAFF层析柱，ProteinASepharoseCL-4B填料乌司他丁的实施例1和实施例10的总收率为87.5％和89.4，总效价为6920iu/mg和6987iu/mg，冻干产品乌司他丁的各项生化指标均优于中国药典要求。

本发明所述的乌司他丁纯化方法，包括以下步骤：

(1)称取适量的pH小于6.5的澄清尿液，加入适量的壳聚糖，并用精密pH试纸测定，调节尿液pH到5.0-6.0；吸附完全后用氨水洗脱1.0-2.0h，再经过3-4kg硫酸铵盐析，静置、沉淀、干燥后即得乌司他丁粗品；