[发明专利]一种鸡输卵管上皮细胞体外分离培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞培养领域，尤其涉及一种鸡原代输卵管上皮细胞体 外分离培养的方法。

背景技术

近年来，蛋鸡产蛋量下降的情况越来越严重，鸡输卵管炎、输卵管囊肿 等是导致各类产蛋鸡的产蛋下降的重要原因，该病是由各种病因引起的产蛋 鸡以输卵管堵塞、干酪性输卵管炎、不同程度的输卵管积液及卵黄性腹膜炎 为特征，临床上表现为病鸡腹部膨大，产蛋量下降、产蛋高峰缺失、蛋壳变 形，饲养成本增高，饲料报酬低，给养殖业带来很大的经济损失，但其病因 及发病机制几十年来一直困惑着国内外业界人士。为揭示诱发该病的病原在 天然宿主体内的定殖和感染机制，成功建立一种体外感染模型是强有力的技 术支撑。

目前，已经有文献报道了原代细胞的分离培养方法，其中最为实用的是 由KasperczykK等通过细胞刮刀刮取与剪切消化最终证实采取输卵管膨大部 进行剪切，用1mg/mL胶原蛋白酶37℃进行组织消化30min，4℃670rcf/min 离心20min，收集细胞经过滤和细胞记数后按照1.0×10⁶细胞/孔接种于 DMEM/F12培养基(1mL/每孔)的12孔聚苯乙烯培养皿，5％CO₂，37℃培养均 可得到较好的鸡输卵管上皮细胞。此外，SeaverSS用激素刺激的雏鸡输卵管 生长后，截取输卵管经过剪切、消化后接种的细胞贴壁快，活力强。

现有技术中用细胞刮刀刮取细胞的方法对细胞损伤较大，且存在成纤维 细胞的干扰；用激素刺激雏鸡得到的细胞虽然贴壁快，活力强，但周期长， 细胞获得率低。因此，建立一种快速高效无污染且对细胞损伤小的鸡输卵管 上皮细胞体外分离培养的方法是本领域急需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速高效无污染且对细胞损伤小

的鸡输卵管上皮细胞体外分离培养的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种鸡输卵管上皮细胞体外分离培养的方法，包括以下步骤：

1)从产蛋鸡靠近卵泡的输卵管漏斗颈部无菌分离组织；

2)使用胰酶和EDTA联合消化所述分离得到的组织，得到鸡输卵管上皮细胞；

3)在37℃的温度下，孵育所述鸡输卵管上皮细胞2h；

4)将所述步骤3)中孵育后的细胞进行细胞培养。

优选的，步骤1)中所述的产蛋鸡为25-28周龄的产蛋鸡。

优选的，步骤1)中所述分离包括采集组织，剪碎组织和清洗组织，所述的剪 碎组织为将采集到的组织剪成边长小于1mm的组织块。

优选的，所述的清洗组织使用的清洗液包括磷酸盐缓冲溶液，所述清洗的次 数为5～8次。

优选的，所述的磷酸盐缓冲溶液含有青霉素和链霉素双抗。

优选的，步骤2)中所述胰酶的浓度为0.2～0.3wt％，所述EDTA的浓度为 0.01～0.03wt％。

优选的，步骤2)中所述消化的时间为10～20min。

优选的，步骤3)中所述孵育的温度为37℃，所述孵育环境中CO₂的体积浓 度为5％。

优选的，步骤4)中所述的细胞培养的装置为15～25％胎牛血清包被过的一次 性T₂₅培养瓶。

优选的，步骤4)中所述的细胞培养用的培养基包括以下组分：含有体积分数 为4～6％的胎牛血清的DMEM/F12，15～25g/L表皮生长因子，80～120mg/L 肝素钠，2～3mg/L胰岛素，180～220mmol/L谷氨酰胺，180～220μg/mL青 霉素，180～220μg/mL链霉素。

本发明的有益效果：本发明从靠近卵泡的输卵管漏斗颈部分离细嫩组织，分 离培养的原代鸡输卵管上皮细胞效果好，细胞生长速度快，状态良好；本发 明消化时间短，结果良好，杂细胞少，避免成纤维细胞的污染可得到健全的 上皮样细胞群，且具有呈单层成簇生长，细胞之间有紧密接触等上皮细胞结 构特点。

说明书附图

图1为0.25％胰酶和0.02％EDTA联合消化15min的鸡原代输卵管上 皮细胞的生长动态过程；

图2为鸡原代输卵管上皮细胞生长曲线；