[发明专利]一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法

权利要求书

1.一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)利用Talen技术，建立Brn3-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Brn3-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的节细胞前体细胞筛选并纯化；

(2)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的节细胞前体细胞进行筛选，确定一种节细胞表面蛋白；

(3)为了证实筛选获得的节细胞表面蛋白是否仅仅表达在节细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞；

(4)证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面；

(5)确定筛选获得的表面蛋白特异性的表达在人胚胎视网膜和/或成年人视网膜的节细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与脑片组织的共培养来初步确定，如果得到的细胞具有功能，则该细胞与小鼠脑片组织共培养后，将会看到节细胞会伸出长的轴突，并与脑片组织的特定部分形成突触联系；

在确定了得到的细胞可以与小鼠脑片组织形成突触联系之后，利用青光眼小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球的玻璃体腔靠近节细胞层的部位；观察是否可以替代小鼠受损的节细胞改善小鼠的视觉功能。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，将获得的表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成长的轴突；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(4)中，为了证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面，对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色，观察筛选获得的表面蛋白是否特异性地表达在节细胞膜表面。