[发明专利]一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及视网膜细胞方面，具体涉及一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法。

背景技术

视觉是机体最重要的感觉功能，视觉系统疾病分为可逆性(如：白内障)和不可逆性(如：青光眼)两大类。调查结果表明，截至2010年，全世界大约有6050万青光眼患者，并且这种疾病的发病呈上升态势，预计到2020年大约会升至7960万。青光眼主要累及视网膜节细胞，导致视神经受损，使得视觉传导通路障碍，视觉信号不能正常传递到中枢神经系统。青光眼的主要致病因素为眼压升高，但青光眼发病早期几乎没有症状，且往往在临床诊断之前已经发生了严重的视力丧失。目前治疗青光眼的主要手段就是降低眼内压，但只能减缓青光眼的病程进展，并不能完全阻止病情的发展，因此，基于干细胞的节细胞移植疗法给青光眼的逆转和治愈带来了新的希望。目前的研究结果显示，间充质干细胞、胚胎干细胞、视网膜前体细胞以及Müller细胞移植后可以与宿主的视网膜节细胞发生整合，甚至有些移植的细胞可能表达一些节细胞特异性蛋白。而诱导的多能干细胞来源的节细胞样细胞则不能和宿主的视网膜节细胞发生整合。另外，即使移植的细胞可以发生整合，但没有发现模型动物表现出视觉功能的改善，可能是移植的细胞不能地很好与视觉中枢系统建立突触联系有关。

目前，细胞替代疗法治疗神经元退行性疾病首要解决的问题是细胞纯度的问题。其原因显而易见，首先，将诱导分化的细胞在体外进行药物筛选或功能鉴定时，混杂的其它细胞将会影响结果的可靠性；其次，如果将混杂的细胞移植到模型动物体内，将会产生异常增生甚至致瘤的风险。虽然目前已经有很多研究致力于提高节细胞的诱导分化率，例如：将Math5转染到干细胞，然后通过FACS筛选来获得纯化的节细胞，然而，这些方法存在致命缺陷，即：将报告载体转染到干细胞内会导致干细胞基因组的改变，从而限制了其临床应用。

发明内容

本发明的目的在于一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，从而 找到节细胞前体细胞的特异性表面蛋白，用于人胚胎干细胞/人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化，从而加快临床利用细胞移植替代疗法治疗青光眼。

本发明的具体技术方案如下：

一种构建验证视网膜节细胞特异性表面蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)利用Talen技术，建立Brn3-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Brn3-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的节细胞前体细胞筛选并纯化；

(2)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的节细胞前体细胞进行筛选，确定一种节细胞表面蛋白；

(3)为了证实筛选获得的节细胞表面蛋白是否仅仅表达在节细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞；

(4)证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面；

(5)确定筛选获得的表面蛋白特异性的表达在人胚胎视网膜和/或成年人视网膜的节细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与脑片组织的共培养来初步确定，如果得到的细胞具有功能，则该细胞与小鼠脑片组织共培养后，将会看到节细胞会伸出长的轴突，并与脑片组织的特定部分形成突触联系；

在确定了得到的细胞可以与小鼠脑片组织形成突触联系之后，利用青光眼小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球的玻璃体腔靠近节细胞层的部位；观察是否可以替代小鼠受损的节细胞改善小鼠的视觉功能。通过体外电生理检测和体内的移植实验来证实纯化的节细胞具有功能，从而探讨纯化的节细胞对受损视网膜结构与功能修复的作用。

步骤(3)中，将获得的表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成长的轴突；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。

步骤(4)中，为了证实筛证实筛选获得的表面蛋白是否特异性的表达在节细胞膜表面，对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表 面蛋白的染色，观察筛选获得的表面蛋白是否特异性地表达在节细胞膜表面。