[发明专利]一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法

权利要求书

1.一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将人多能干细胞诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶的Hanks溶液中消化过夜，得到细胞悬液；

(2)第二天，在细胞悬液中加入等体积的含有Ⅱ型胶原酶、牛磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的Hanks溶液进一步消化，获得单细胞；

(3)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对消化的单细胞进行筛选、筛选出CD抗体，然后对CD抗体进行筛选、确定节细胞特异性表面蛋白。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于将步骤(2)得到的单细胞用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，然后进行步骤(3)的操作。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤(1)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于步骤(1)中，所述消化是在25℃的条件下进行消化。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的筛选方法，其特征在于步骤(2)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml、牛血清白蛋白的质量浓度为1mg/ml，牛磺酸的物质的量浓度为10mM/ml、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的物质的量浓度为0.1mM/ml。

6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(3)中具体筛选方法如下：a、对单细胞表面蛋白进行染色，然后用LSRII流式细胞仪进行分析，单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的PBS溶液中进行；b、选用BD公司的FACS Aria TMII细胞分选仪对10⁶/ml的单细胞进行分选，分选过程中单细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液；c、选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选、分选出CD抗体，选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析对于CD抗体的高通量细胞流式分析；d、所得到的数据应用流式分析软件Treestar进行分析，确定节细胞特异性表面蛋白。