[发明专利]一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及视网膜细胞方面，具体涉及一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法。

背景技术

视觉是机体最重要的感觉功能，视觉系统疾病分为可逆性(如：白内障)和不可逆性(如：青光眼)两大类。调查结果表明，截至2010年，全世界大约有6050万青光眼患者，并且这种疾病的发病呈上升态势，预计到2020年大约会升至7960万。青光眼主要累及视网膜节细胞，导致视神经受损，使得视觉传导通路障碍，视觉信号不能正常传递到中枢神经系统。青光眼的主要致病因素为眼压升高，但青光眼发病早期几乎没有症状，且往往在临床诊断之前已经发生了严重的视力丧失。目前治疗青光眼的主要手段就是降低眼内压，但只能减缓青光眼的病程进展，并不能完全阻止病情的发展，因此，基于干细胞的节细胞移植疗法给青光眼的逆转和治愈带来了新的希望。目前的研究结果显示，间充质干细胞、胚胎干细胞、视网膜前体细胞以及Müller细胞移植后可以与宿主的视网膜节细胞发生整合，甚至有些移植的细胞可能表达一些节细胞特异性蛋白。而诱导的多能干细胞来源的节细胞样细胞则不能和宿主的视网膜节细胞发生整合。另外，即使移植的细胞可以发生整合，但没有发现模型动物表现出视觉功能的改善，可能是移植的细胞不能地很好与视觉中枢系统建立突触联系有关。

目前，细胞替代疗法治疗神经元退行性疾病首要解决的问题是细胞纯度的问题。其原因显而易见，首先，将诱导分化的细胞在体外进行药物筛选或功能鉴定时，混杂的其它细胞将会影响结果的可靠性；其次，如果将混杂的细胞移植到模型动物体内，将会产生异常增生甚至致瘤的风险。虽然目前已经有很多研究致力于提高节细胞的诱导分化率，例如：将Math5转染到干细胞，然后通过FACS筛选来获得纯化的节细胞，然而，这些方法存在致命缺陷，即：将报告载体转染到干细胞内会导致干细胞基因组的改变，从而限制了其临床应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，从而 找到节细胞前体细胞的特异性表面蛋白，用于人胚胎干细胞/人多能干细胞来源的视网膜节细胞前体细胞的纯化，从而用于临床利用细胞移植替代疗法治疗青光眼。

本发明的具体技术方案如下：

一种视网膜节细胞特异性表面蛋白的筛选方法，包括如下步骤：

(1)将人多能干细胞诱导分化至第6周的视网膜细胞球在含有Ⅱ型胶原酶的Hanks溶液中消化过夜，得到细胞悬液；

(2)第二天，在细胞悬液中加入等体积的含有Ⅱ型胶原酶、牛磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的Hanks溶液进一步消化，获得单细胞；

(3)应用BD公司的细胞表面蛋白筛选试剂盒对消化的单细胞进行筛选、筛选出CD抗体，然后对CD抗体进行筛选、确定节细胞特异性表面蛋白。

如果细胞球过硬，不容易消化，为了充分分散细胞球，将步骤(2)得到的单细胞用0.25％胰酶/EDTA进一步消化，然后进行步骤(3)的操作。

步骤(1)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml。

步骤(1)中，所述消化是在25℃的条件下进行消化。

步骤(2)中，Hanks溶液中Ⅱ型胶原酶的质量浓度为1mg/ml、牛血清白蛋白的质量浓度为1mg/ml，牛磺酸的物质的量浓度为10mM/ml、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸的物质的量浓度为0.1mM/ml。

所述步骤(3)中具体筛选方法如下：a、对单细胞表面蛋白进行染色，然后用LSRII流式细胞仪进行分析，单细胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的PBS溶液中进行；b、选用BD公司的FACS Aria TMII细胞分选仪对10⁶/ml的单细胞进行分选，分选过程中单细胞重悬液为含有6％胎牛血清的PBS溶液；c、选用Mitenyi MACS磁珠分选系统进行磁珠分选、分选出CD抗体，选用BD公司针对LSRII的高通量样品分析对于CD抗体的高通量细胞流式分析；d、所得到的数据应用流式分析软件Treestar进行分析，确定节细胞特异性表面蛋白。