[发明专利]基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物分子的定量方法，尤其是涉及一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，主要涉及与生物质谱相关的系统生物学、蛋白质组学等技术领域。

背景技术

同位素、同重、或近同重标记现已广泛用于蛋白的定量分析。标记过程中，标记试剂与蛋白质N端氨基、C端羧基、或氨基酸序列上残基上的官能团中的一个或多个发生反应，生成新的共价官能团。这些新的官能团的电离效率往往较原来的官能团的低，从而导致标记后蛋白质的分析效率较低。

申请人前期在整体蛋白质定性定量分析方面已经做了较多的工作，有较好的基础。

在定量数据挖掘方面，公布号为CN103389335A的中国专利公布了一种鉴定生物大分子的分析装置和方法。公布号为CN 104765984A的中国专利公布了一种生物质谱数据库快速建立与搜索的方法。公布号为CN104359967A的中国专利公布了一种生物质谱重叠同位素轮廓的解析方法。上述专利中公布了同位素轮廓指纹比对算法(isotopic envelope fingerprinting，iEF)，直接在原始数据上进行匹配离子的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理，可以节省相应的时间；根据各个离子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相对强度的偏差对理想及非理想实验数据进行很好的区分，保证蛋白鉴定的可信度；根据已知重叠离子的同位素峰相对强度关系对重叠实验数据进行有效的解析。基于该算法申请人成功地开发了整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle，在单个标准蛋白(泛素、肌红蛋白)及整体蛋白质组混合物(组蛋白H4家族翻译后修饰异构体、大肠杆菌)的定性鉴定中，表现出较高的可信度和较好的应用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有着它内在的和独特的潜在优势；一方面基于同位素轮廓及其中每个同位素的指纹比对可以快速精确地搜索同位素或同重标记的定量离子对；另一方面，搜索过程中每个离子中每个同位素峰的实验强度都被记录和输出，可以用来直接计算相对定量比。

在定量标记方面，公布号为CN105137088A的中国专利公布了一种整体蛋白质定量分析方法。公布号为CN105242050A的中国专利公布了一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法，该专利对N端氨基进行同重标记，分别标记为-N(CH₂D)₂和-N(¹³CH₃)₂。上述两份专利均是基于重同位素的定量标记方法。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种标记效率高且标记蛋白电离效率高的整体蛋白质定量方法，本发明的方法可以实现相对或绝对标记定量；同时保证了分析的灵敏度和效率。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种基于自带电荷同位素试剂的生物分子标记和定量分析方法，包括以下步骤：

(1)将两组不同生理或病理条件的整体蛋白分别作为控制组与疾病组，分别进行赖氨酸ε-氨基及N端氨基全部同重标记，分别标记为-N(C₁₁¹³CH₁₁N⁺OCH₂)₂和-N(C₁₂H₁₁¹⁵N⁺OCH₂)₂，其单个标记后氨基的质量差异为12.6mDa；

(2)同重标记后两组蛋白按等比例混合进行高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组；

(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索，得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例，即疾病条件下所有蛋白的上调或下调情况，上调或下调倍数最大的蛋白即为与该疾病发生、发展相关的蛋白。

优选地，步骤(1)中，控制组蛋白或疾病组蛋白，一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含¹³C的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记，另一组蛋白质用氰基硼氢化钠和含¹⁵N的N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐标记。

N(3-醛基-4-羟基苄基)氯化吡啶鎓盐为自带电荷同位素试剂，合成方法可依照文献【马慧敏，等。合成化学，2014,22(2)，230-233】来进行。