[发明专利]利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法

说明书

本发明涉及一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，该方法步骤如下：(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱‑20℃保存备用。(2)蜜蜂基因组DNA提取：取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，组织破碎后，使用酚仿抽提法提取DNA，进行DNA浓度和纯度测定。(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应。引物为：F：5’‑TGATAAAAGAAATATTTTGA‑3’，R：5’‑GAATCTAATTAATAAAAAA‑3’。PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌双蒸水补足体积。本发明的有益效果为：利用线粒体DNA分子标记进行浙江浆蜂品种鉴定，操作简单，稳定性好。

技术领域

本发明属于畜牧品种鉴定技术领域，具体涉及一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法。

背景技术

我国是世界第一养蜂大国，更是世界蜂王浆的主要生产国和出口国，蜂王浆产量和出口量均占世界90％以上。中国蜂王浆产量居世界首位很大程度上归功于20世纪80年代我国培育成功的王浆高产蜂种—浙江浆蜂。浙江浆蜂已被列入国家畜禽遗传资源目录。目前浙江浆蜂已推广至除西藏外的全国各地，在我国蜂种市场占有重要地位，在我国蜂王浆生产中发挥着重要作用。

目前蜂种鉴定的主要方法还是形态学测定，费时费力，误差较大，尤其是亲缘关系相近的蜂种很难从形态上快速鉴别。目前还没有用于浙江浆蜂品种鉴定的快速有效方法，严重影响了浙江浆蜂种蜂业的健康发展，迫切需要用于浙江浆蜂品种鉴定的快速有效的技术手段。

线粒体DNA是动物细胞核外唯一的遗传物质，具有结构简单、进化速度快、母系遗传和基因重组率小等特点。此外，由于蜜蜂特殊的生殖机制，一个蜂群中所有的工蜂都拥有与蜂王相同的线粒体DNA，一只工蜂就可代表蜂王和整个蜂群，这就大大减少了工作量，使其成为研究蜜蜂分类和品种鉴定的一种重要的遗传标记。NADH脱氢酶第二亚基(NADHdehydrogenase subunit 2，ND2)是线粒体电子传递链复合体的组分之一。很多研究表明,与线粒体其他蛋白质编码基因和rRNA基因相比，ND2基因具有更快的进化速率。许多学者已经将ND2基因序列应用于动物分类研究并显示出其良好的分子标记特性。因此，申请人开展了蜂线粒体ND2基因序列的克隆、多态位点筛查及其用于浙江浆蜂品种鉴定的方法。

发明内容

本发明的目的正是为了克服上述技术的不足，而提供一种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，本发明目的在于筛选与浙江浆蜂品种相关的分子标记，应用该分子标记进行浙江浆蜂品种鉴定。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种利用线粒体分子标记鉴定浙江浆蜂的方法，该方法步骤如下：

(1)蜜蜂取样：从考察的西方蜜蜂蜂群中，随机取封盖期蜜蜂工蜂个体1只，放于冰箱-20℃保存备用。

(2)蜜蜂基因组DNA提取：取步骤(1)中保存的蜜蜂样本的头部和胸部，组织破碎后，使用酚仿抽提法提取DNA，进行DNA浓度和纯度测定。

(3)PCR扩增和测序：以步骤(2)中获得的基因组DNA为模板进行PCR反应。引物为：F：5’-TGATAAAAGAAATATTTTGA-3’，R：5’-GAATCTAATTAATAAAAAA-3’。PCR反应体系为：总体积20μL，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物F和R各0.8μL，DNA模板2μL，5U/μLTaq酶0.2μL，灭菌双蒸水补足体积。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性1min，42℃退火2min，72℃延伸2min，共30个循环，72℃后延伸10min。将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增成功后进行测序。